硫酸软骨素裂解酶产生菌的筛选、鉴定及其酶固定化方法的研究

论文摘要

硫酸软骨素裂解酶（chondroitinase或chondroitin sulfate lyase, ChSase）具有多种药用价值,尤其在制备低分子量硫酸软骨素方面有着广阔的应用前景。本论文对ChSase产生菌的筛选、菌株的鉴定及其产酶特性、酶学性质与酶的固定化方法做了系统的研究。利用快速平板筛选法从鲤鱼鱼肠标本中筛选出一株产ChSase活性较高的菌株N235,通过形态学观察和生理生化试验,以及对该菌株16srRNA基因序列的分析,将菌株N235归属为温和气单胞菌；对ChSase的表达方式和菌株产酶特性的研究表明,ChSase为胞外酶,菌株N235在30℃发酵36h时产ChSase活性达到最高；采用硫酸铵沉淀法制备了粗酶液,并考察了ChSase的酶学性质。利用制备的粗酶液为原料,分别使用明胶和海藻酸钠、大孔树脂、磁性PF微球为载体,进行ChSase固定化方法的研究。结果表明：（1）明胶和海藻酸钠协同包埋固定化ChSase的优化条件是：明胶浓度10%,海藻酸钠浓度2%,氯化钙浓度4%,加酶量1U／ml体系,交联剂戊二醛浓度0.05%-0.07%,交联时间10min；利用此条件获得的固定化酶的酶学性质为：最适温度45℃,最适pH 7.5,表观米氏常数7.06×10-2g/L,具有一定的操作稳定性。（2）大孔树脂吸附固定化ChSase的优化条件是：吸附温度15℃,吸附时间6 h,吸附pH7.0,加酶量150U／g树脂,交联剂戊二醛浓度0.01%,交联时间3h,交联温度4℃；利用此条件获得的固定化酶的酶学性质为：最适温度40℃-50℃,最适pH 7.0,表观米氏常数1.46×10-1 g/L,具有较好的操作稳定性。（3）磁性PF微球固定化ChSase的优化条件是：对苯二酚8.2g,甲醛15ml,盐酸2ml制备PF凝胶；PF凝胶1.5g制备磁性PF微球；固定温度20℃、固定时间8h、加酶量67.3U／g磁性PF微球制备固定化酶；利用此条件制备的固定化酶的酶学性质为：最适温度50℃,最适pH 8.0,表观米氏常数5.23×10-1g/L,具有良好的操作稳定性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 硫酸软骨素简介
• 1.2 硫酸软骨素裂解酶概述
• 1.2.1 硫酸软骨素裂解酶简介
• 1.2.2 国内外现状
• 1.3 固定化酶概述
• 1.3.1 固定化酶的定义
• 1.3.2 酶的固定化方法
• 1.3.3 载体改性及新型载体、新型技术的应用
• 1.3.4 展望
• 1.3.5 固定化酶的性质
• 1.4 本论文的立题背景和研究意义
• 1.5 本论文的研究内容
• 第二章 硫酸软骨素裂解酶产生菌的筛选、鉴定与产酶特性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 培养基
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 ChSase产生菌的筛选
• 2.2.2 ChSase在菌体内表达方式的确定
• 2.2.3 菌株N235的生长曲线与产酶特性的关系
• 2.2.4 菌株N235的菌种鉴定
• 2.2.5 ChSase活力的测定方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 ChSase产生菌的筛选
• 2.3.2 ChSase在菌体内表达方式的确定
• 2.3.3 菌株N235的生长曲线与产酶特性的关系
• 2.3.4 菌株N235的菌种鉴定
• 2.3.5 菌种归类判定
• 2.4 本章小结
• 第三章 硫酸软骨素裂解酶酶学性质及固定化方法的研究
• 3.1 ChSase粗酶液的制备及其酶学性质的考察
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 实验结果
• 3.2 ChSase固定化方法的研究
• 3.2.1 明胶海藻酸钠协同包埋法
• 3.2.2 树脂吸附法
• 3.2.3 磁性高分子微球法
• 3.3 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录