海绵放线菌的分离和多样性研究

论文摘要

放线菌是一类有重要价值的微生物资源。约70%左右的抗生素都由其产生。海绵是最原始的无脊椎海洋生物,底栖滤食的特性使其体内富集了大量的微生物,成为海洋微生物的资源库。对于海绵中放线菌进行分离将是获得和应用海洋放线菌资源的一条重要途径。论文以大连海域繁茂膜海绵为模式体系,重点研究海绵放线菌的分离条件及培养基。在探索出适宜方法的同时分得放线菌244株,系首次从海绵中大量分离获得放线菌株的研究。以HhaI进行的16S rDNA-RFLP分析显示,分离得到的放线菌可分为11种谱带类型。首次提出采用HhaI的16S rDNA-RFLP分析能对放线菌进行属一级别的鉴定。对菌株测序表明繁茂膜海绵中分离得到的放线菌包含7个不同属。除链霉菌属外都是首次从海绵中分离到,其中假诺卡氏和异壁放线菌两属系首次从海洋环境中分离。分离株HPA177通过对培养形态、生理实验、化学组成和16S rDNA鉴定证明其为异壁放线菌属的一个新种,命名为繁茂膜异壁放线菌（Actinoalloteichus hymeniacidonis. sp. nov.）利用已建立的海绵放线菌分离的方法,对其它5种海绵进行了放线菌分离,获得菌株181株。通过海绵种类,分布和从中分离得到的放线菌分析。对海绵中放线菌分离方法进行了归纳和总结。对繁茂膜海绵中得到菌株的进行初筛,实验结果表明,具有各类抗菌活性的菌株数目为148株,约占菌株的61%。抗肿瘤筛选中,20.0%的放线菌具有超过50%的抑制肿瘤细胞生长能力。发现一株抗菌抗肿瘤活性都很强的B37,在培养优化基础上进行25L规模的发酵和提取。分离得到环肽化合物maculosin,系该化合物首次从革兰氏阳性菌中产生。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 海绵微生物
• 1.1.1 海绵及海绵微生物简介
• 1.1.2 海绵微生物种类多样性
• 1.1.3 海绵中微生物的分布及其作用
• 1.1.4 海绵微生物和海绵天然产物
• 1.2 海绵放线菌分离
• 1.2.1 放线菌简介
• 1.2.2 海洋放线菌
• 1.2.3 放线菌分离
• 1.2.3.1 陆生放线菌分离
• 1.2.3.1.1 放线菌分离样品前处理
• 1.2.3.1.2 分离培养基和抗生素
• 1.2.3.1.3 放线菌分离培养温度和时间
• 1.2.3.1.4 其它放线菌分离技术介绍
• 1.2.3.2 海洋放线菌分离
• 1.2.3.3 海绵放线菌分离
• 1.2.3.3.1 海绵微生物分离方式
• 1.2.3.3.2 海绵微生物分离培养基和培养方法
• 1.2.3.3.3 海绵放线菌分离
• 1.3 放线菌鉴定技术
• 1.4 海绵微生物资源开发前景
• 1.4.1 海绵微生物分离培养深入研究
• 1.4.2 未可培养水平海绵微生物多样性研究
• 1.4.3 海绵微生物活性产物基因开发
• 1.5 课题研究背景和计划
• 1.5.1 研究背景
• 1.5.2 研究计划
• 参考文献
• 第二章 繁茂膜海绵中放线菌的分离研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料及仪器
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 海绵样品的前处理
• 2.3.2 放线菌分离培养基
• 2.3.3 海绵中放线菌的分离培养
• 2.3.4 海绵组织的电镜分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 海绵中微生物的电镜观察
• 2.4.2 海绵中放线菌的分离结果
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 繁茂膜海绵中可培养放线菌多样性研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 仪器和试剂
• 3.2.1.1 仪器
• 3.2.1.2 试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 海绵中可培养放线菌基因组 DNA 的提取
• 3.3.2 放线菌16S rDNA 的 PCR 扩增
• 3.3.3 PCR 产物凝胶电泳
• 3.3.4 适于放线菌16S rDNA RFLP 限制型内切酶筛选
• 3.3.5 海绵放线菌16S rDNA 的RFLP 分析
• 3.3.6 16S rDNA 产物纯化和测序分析
• 3.3.7 16S rDNA 系统发育树分析和Vector NTI 模拟电泳分析
• 3.3.8 GenBank 序列号申请
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 放线菌基因组 DNA 提取
• 3.4.2 16S rDNA 的 PCR 反应结果
• 3.4.3 RFLP 限制型内切酶筛选结果
• 3.4.4 RFLP 结果
• 3.4.5 海绵放线菌的16S rDNA 的序列分析
• 3.5 小结
• 参考文献
• 第四章 HPA177 菌种的鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 测试菌株
• 4.2.2 培养、形态和生理生化鉴定
• 4.2.3 菌株HPA177 的16S rDNA 序列分析
• 4.3 鉴定结果
• 4.4 讨论
• 参考文献
• 第五章 海绵放线菌分离技术的推广研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料和试剂
• 5.1.1.1 海绵样品
• 5.1.1.2 实验试剂及仪器
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 海绵放线菌的分离培养
• 5.1.2.1.1 分离方法
• 5.1.2.1.2 放线菌分离培养基
• 5.1.2.1.3 分离放线菌的纯化和培养
• 5.1.2.2 海绵中放线菌鉴定和多样性研究
• 5.1.2.3 序列号申请
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 海绵中放线菌的分离结果
• 5.2.2 海绵中放线菌16S rDNA 扩增结果
• 5.2.3 RFLP 结果
• 5.3 小结
• 参考文献
• 第六章 繁茂膜海绵中放线菌的活性筛选
• 6.1 海绵放线菌的抗菌活性筛选
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 抗菌活性筛选待测菌株
• 6.1.1.2 测试菌
• 6.1.2 活性菌株筛选方法
• 6.1.2.1 琼脂块法
• 6.1.2.2 发酵液牛津杯法
• 6.1.3 筛选结果
• 6.2 海绵放线菌的抗肿瘤活性筛选
• 6.2.1 材料
• 6.2.1.1 细胞株
• 6.2.1.2 仪器与药品
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.2.1 肿瘤细胞的培养
• 6.2.2.1.1 细胞活化
• 6.2.2.1.2 细胞的传代与保存
• 6.2.2.2 待测样品的配制
• 6.2.2.3 MTT 法检测发酵液的细胞毒活性
• 6.2.3 实验结果
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 参考文献
• 第七章 繁茂膜海绵分离株 B37 的鉴定研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 供试菌株
• 7.1.2 主要仪器和药品
• 7.1.3 鉴定方法
• 7.1.3.1 显微镜和电镜下对孢子和孢子丝观察
• 7.1.3.2 不同培养基上菌落形态、菌丝和可溶性色素观察
• 7.1.3.3 部分生理生化实验
• 7.1.3.4 唯一碳源利用实验
• 7.1.3.5 16S rDNA 序列测定和序列分析
• 7.2 实验结果
• 7.2.1 链霉菌 B37 的鉴定
• 7.2.1.1 形态培养特征
• 7.2.1.2 生理生化鉴定结果
• 7.2.1.3 鉴定结果
• 7.3 小结
• 参考文献
• 第八章 B37 的发酵和产物提取
• 8.1 材料
• 8.1.1 实验试剂和仪器
• 8.1.2 供试菌株
• 8.1.3 抗菌活性测定菌株
• 8.1.4 培养基
• 8.2 实验方法
• 8.2.1 发酵及发酵液优化实验
• 8.2.1.1 培养基的优化
• 8.2.1.2 发酵液热稳定性研究
• 8.2.1.3 发酵液萃取的pH 稳定性研究
• 8.2.2 发酵液的浓缩
• 8.2.3 发酵液的薄层层析（TLC）
• 8.2.4 发酵液有机相的生物自显影研究
• 8.2.5 发酵液的柱层析提取
• 8.2.6 发酵液活性产物的结构研究
• 8.3 实验结果
• 8.3.1 发酵优化结果
• 8.3.2 发酵液处理结果
• 8.3.3 薄层层析流动相优化结果
• 8.3.4 薄层层析生物自显影研究结果
• 8.3.5 发酵液的柱层析分离研究和结构解析
• 8.4 小结
• 参考文献
• 第九章 总结
• 附录 1
• 附录 2
• 作者简介
• 攻读博士学位期间发表文章目录
• 获奖情况
• 致谢