无核荔枝花与果实发育相关基因的克隆和功能分析

论文题目: 无核荔枝花与果实发育相关基因的克隆和功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物栽培学与耕作学

作者: 禤维言

导师: 郑学勤

关键词: 无核荔枝,花发育,基因,果实发育,抑制消减杂交

文献来源: 华南热带农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 荔枝是我国南方亚热带地区主要的特产水果之一,其色、香、味皆美而深受广大消费者的喜爱,具有极高的经济价值。而海南无核荔枝则是荔枝中的特优品种,其无核率高达95%。但是其两性花所占的比例很小,主要依靠雌花结实,而三种类型的花不完全在同一时间开放,常导致雌、雄花花期不遇,使结实率降低。并且果实的无核率不稳定,容易受开花期温度变化的影响。无核率的不稳定性严重影响了该品种的推广种植及其生产的经济效益。 研究表明MADS-box家族多数基因参与调控花的分化发育,少数基因调控胚胎的发育。调控胚胎发育的MADS-box基因如果发生了突变,会导致无核果实的形成。荔枝的组织形态学研究显示无核荔枝无核果实的形成是由于胚胎败育而引起。所以开展与无核荔枝胚胎发育相关的MADS-box基因及胚胎败育相关基因的研究具有重要意义。本论文开展了与无核荔枝花发育相关MADS-box基因的克隆和功能分析以及与无核果实形成相关基因的克隆研究工作。旨在了解无核荔枝无核果实发育形成的分子机理。通过本论文的研究工作得到的主要结果如下: 1.根据多种植物的MADS-box区域保守序列设计简并引物,采用RT-PCR及3′-RACE方法获得了与无核荔枝花发育相关的基因LMADSI,在NCBI-GenBank上的登录号为AY705793。该基因包含了MADS-box家族基因所具有的完整的MADS区与K区,说明其属于典型的MADS-box基因。 2.利用LMADS1基因非保守的3′-端序列为探针,对其在基因组中的拷贝数及其表达特异性分别进行了Southem blot与Northern blot分析,结果显示该基因在无核荔枝基因组中以单拷贝的形式存在,而且只在雌花和雄花中表达,在叶片和幼果中不表达。说明LMADSI基因不参与果实形成的发育调控。 3.把LMADSI基因置于35S启动子之后,克隆到植物表达载体pCAMBIA1301质粒上,通过农杆菌介导转化拟南芥。T1代种子经抗性筛选后共得到60株抗性植株,取其中的17株进行PCR检测,有13株为阳性植株。随机挑选PCR检测为阳性

论文目录:

第一章 前言

1.综述

1.1 荔枝开花的特点及环境影响因素

1.1.1 荔枝的花芽分化

1.1.2 影响荔枝花芽分化的环境因素

1.2 荔枝的结实特点及其影响因素

1.2.1 荔枝胚胎发育的类型

1.2.2 荔枝胚胎的发生发育

1.2.3 假种皮的发育与成熟

1.2.4 影响果实发育的因素

1.3 植物花的发育与MADS盒基因的关系

1.3.1 花的分化发育过程及其调控基因

1.3.2 MADS盒基因与花器官形成的关系

1.4 植物胚胎发育生理生化机制的研究

1.4.1 植物激素与果实发育的关系

1.4.2 植物激素与无核果实的关系

1.4.3 植物激素诱导无核果实的应用研究

1.5 植物胚胎发育的基因调控

1.5.1 原胚期的基因调控

1.5.2 球形胚-心形胚过度期的基因调控

1.5.3 器官形成与成熟期的基因调控

1.6 荔枝的分子生物学研究

1.7 抑制消减杂交(SSH)的特点

2 研究的目的和意义

3 实验设计

第二章 无核荔枝花发育相关MADS-box基因的克隆

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 无核荔枝花蕾总RNA的提取

1.2.2 RT-PCR引物设计与合成

1.2.3 RT-PCR扩增

1.2.4 RT-PCR片段的回收

1.2.5 回收的RT-PCR片段与T-载体连接

1.2.6 感受态细胞的制备

1.2.7 重组质粒转化感受态细胞

1.2.8 提取白色单菌落的质粒酶切鉴定阳性及测序

1.2.9 3’-RACE法获得目标片段的3’端序列

1.2.10 序列分析

2.结果与分析

2.1 无核荔枝花蕾总RNA的提取结果

2.2 RT-PCR和3’-RACE及回收条带

2.3 阳性克隆的鉴定

2.4 目标片段的测序分析与同源性比较

3 讨论

第三章 LMADS1在基因组中的拷贝数及其表达特异性分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 LMADS1在基因组中拷贝数的Southern blot分析

1.2.2 LMADS1在不同器官表达差异的Northern blot分析

2 结果与分析

2.1 Southern blot分析结果

2.1.1 无核荔枝叶片基因组DNA的提取及其酶切

2.1.2 探针制备和Southern杂交

2.2 LMADS1的表达特异性分析

3.讨论

第四章 LMADS1的功能分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 载体构建

1.2.2 农杆菌转化

1.2.3 真空渗透法与浸泡法转化拟南芥

1.2.4 筛选转化子

1.2.5 转基因植株的PCR检测及Southern blot分析

2 结果与分析

2.1 植物表达载体pLMAD的构建

2.2 LMADS1基因转化拟南芥

2.2.1 PCR检测

2.2.2 转化效率及T1代植株的生长情况

2.2.3 Sourhern blot分析结果

2.2.4 转基因拟南芥植株的生长发育

3 讨论

第五章 无核荔枝果实发育相关基因的克隆

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 无核幼果与有核幼果总RNA的提取

1.2.2 RNA电泳检测

1.2.3 mRNA的纯化

1.2.4 无核幼果与有核幼果的表达差异分析

1.2.5 Reverse Northern Dot-Blot鉴定阳性差异片段

1.2.6 Northern Blot分析

1.2.7 序列分析

2 结果与分析

2.1 无核荔枝无核幼果和有核幼果总RNA的提取结果

2.2 无核幼果与有核幼果表达差异SSH结果

2.2.1 PCR扩增结果分析

2.2.2 差减cDNA文库筛选

2.2.3 Reverse Northern Dot-Blot分析

2.2.4 Northern Blot分析

2.2.5 差减cDNA克隆的测序及序列分析

3 讨论

结论

参考文献

致谢

发布时间: 2005-07-27

参考文献

• [1].荔枝（Litchi chinensis Sonn.）花性分化的细胞学及生理生化基础[D]. 肖华山.福建农林大学2002
• [2].荔枝花序上雏形叶衰老机理的研究[D]. 王丛丛.华南农业大学2016

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