SIgA分泌片的原核表达及抗分泌片单克隆抗体的制备

论文摘要

分泌型IgA是人体合成分泌最多的免疫球蛋白,主要存在于泪液、唾液、初乳、胃肠液等外分泌液中,是粘膜局部免疫的最重要因素。分泌型IgA主要由黏膜中的IgA浆细胞分泌,受神经、内分泌、和免疫系统的调节,能够抑制细菌黏附黏膜表面,中和肠道内的毒素、酶和病毒,降低病毒与黏膜的接触,另外对肠道菌群中的革兰氏阴性杆菌具有特殊的亲和力,同时具有对嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒作用和ADCC作用。本研究通过基因工程技术克隆分泌片基因,表达分泌片蛋白,将其制备成单克隆抗体,为建立检测SIgA试剂盒奠定基础。以真核表达质粒为模板,通过PCR扩增出SC基因,将SC基因克隆到原核表达载体PQE80L中,将其转化入大肠杆菌T1, PCR和双酶切鉴定转化菌落,再将质粒转入表达感受态BL21（DE3）,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析靶蛋白的表达,用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目的蛋白。用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定效价,然后与SP2/0瘤细胞融合,经过亚克隆筛选,得到抗SC的单克隆抗体,Western Blot检测抗体。本研究扩增了SC基因,成功构建了其原核表达质粒pQE80L-SC, SDS-PAGE分析蛋白大小为70kd,与理论值一致。使用纯化后的蛋白免疫小鼠,得到高效价的多克隆血清,将小鼠脾细胞与SP2/0瘤细胞融合,筛选到2株分泌单克隆抗体的细胞株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 SIgA的研究进展
• 1.1 SIgA的结构及其组成成分
• 1.2 SIgA的功能和作用
• 1.3 SIgA与疾病的关系
• 1.3.1 呼吸道和胃肠道疾病
• 1.3.2 泌尿生殖系统疾病
• 1.3.3 肝胆疾病
• 1.3.4 癌症
• 1.3.5 其它疾病
• 1.4 SC在SIgA中的作用
• 1.4.1 SC与疾病的关系
• 1.5 本试验研究的背景和目的意义
• 第二章 SC基因克隆构建及表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒及菌株
• 2.1.2 寡核苷酸引物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 培养基及溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCR方法扩增SC基因
• 2.2.2 重组pQE80L-SC质粒的构建
• 2.2.3 重组pQE80L-SC质粒的鉴定
• 2.2.4 重组质粒pQE80L-SC在BL21（DE3）中的表达
• 2.2.5 SDS-PAGE分析
• 2.2.6 重组蛋白表达形式分析
• 2.2.7 包涵体的纯化回收
• 2.3 结果
• 2.3.1 PCR扩增SC基因
• 2.3.2 SC基因的测序结果
• 2.3.3 重组pQE80-SC质粒的PCR鉴定
• 2.3.4 对阳性克隆的酶切鉴定
• 2.3.5 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达形式和溶解性分析
• 2.3.6 不同浓度尿素溶解分析
• 2.3.7 SC的纯化分析
• 2.3 讨论
• 第三章 抗SC单克隆抗体的制备
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 免疫小鼠
• 3.2.2 间接ELISA建立
• 3.2.3 骨髓瘤细胞的培养
• 3.2.4 饲养细胞的制备
• 3.2.5 脾细胞与瘤细胞的融合
• 3.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆
• 3.2.7 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 3.2.8 单克隆抗体的制备
• 3.2.9 Western blot实验
• 3.2.10 单克隆抗体分型鉴定
• 3.2.11 单克隆抗体的纯化
• 3.3 结果
• 3.3.1 小鼠免疫的效价图
• 3.3.2 饲养细胞的细胞形态
• 3.3.3 杂交瘤细胞的细胞形态
• 3.3.4 Western Blot检测抗体
• 3.3.5 单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定
• 3.3.6 单克隆抗体分子量SDS-PAGE鉴定
• 3.4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介