羽苔素E与唑类药物对耐药白念珠菌的联合作用及机制研究

论文摘要

近二十年来,深部真菌感染的发病率正在逐年上升。尽管致病性真菌种类繁多,但白念珠菌仍然是院内真菌感染最常见的致病性真菌,其系统性感染死亡率高,是引起癌症患者和艾滋病患者死亡的主要原因。在抗真菌药物中,氟康唑应用最为广泛,但是由于长期大量使用,已产生了越来越多的氟康唑耐药白念珠菌。而且,对氟康唑耐药的临床分离白念珠菌株通常对其他唑类药物也能够产生交叉耐药。针对上述问题,药物联合应用治疗真菌感染的研究正在大量展开,以期为真菌感染寻找可行的解决方法。药物联用具备多种优势,如扩大抗菌谱,提高抗菌效能,提高安全性与耐受性,不易诱发耐药等。已报道的联合用药多局限在少数抗真菌药物之间的合用,有些抗真菌药物合用后反而会产生拮抗作用,并且针对氟康唑耐药的临床白念珠菌的联合治疗报道较少。羽苔素E是从苔藓类植物地钱中提取的双联苄类化合物,初步的抗菌活性筛选表明具有潜在的抗真菌活性,前期的实验结果证实对于氟康唑耐药株,羽苔素E与氟康唑合用能明显降低两药的用药量,增加氟康唑在耐药株细胞内的聚集,对耐药株表现出协同的抗真菌作用。并且在高剂量（128μg/ml）下,羽苔素E可明显抑制白念耐药株主动外排基因CDR1的表达水平。本课题研究羽苔素E与氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑合用对临床分离氟康唑耐药白念珠菌的抗真菌作用,并对其逆转机制作进一步探讨。首先,采用NCCLS M-27A方案测定羽苔素E及氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑的体外敏感性,结果显示3株临床分离氟康唑耐药白念珠菌对其他三个唑类药物均显示出抗药性,羽苔素E对实验菌株的抗真菌活性与氟康唑相比较强。通过体外实验棋盘式微量稀释法检测了羽苔素E与氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑合用对上述3株白念珠菌的MIC值,计算其相应的FICI指数,结果表明合用对3株菌均表现出协同作用（FIC≤0.5）。对于临床耐药白念珠菌CA10,时间-杀菌曲线实验中发现,羽苔素E与四种不同唑类联合后,活菌浓度常用对数值比唑类单用组均降低了≥21gCFU/ml,进一步证实了两药的协同作用。并且体外实验实验结果显示两药合用对菌株生长曲线的抑制作用具有羽苔素E剂量依赖性,当氟康唑浓度为8μg/ml时,与三个不同浓度组羽苔素E合用后,其三个组的抑制作用差异有统计学意义（P＜0.01）。在此基础上,观察了羽苔素E对白念珠菌中若丹明6G泵出的影响。若丹明6G是白念珠菌细胞膜上能量依赖性ABC转运蛋白的底物,对它的转运能力可以判断外排泵蛋白的底物转运功能。羽苔素E对白念珠菌中若丹明6 G泵出实验结果发现,8μg/ml的羽苔素E能够显著抑制若丹明6G的泵出,并且随着羽苔素E给药浓度的提高,这种泵出抑制作用呈剂量依赖性增强。为了确定羽苔素E抑制若丹明6G泵出的机制是否是通过降低ABC转运蛋白转录水平而起作用,我们应用RT-PCR法检测了若丹明泵出过程中（即与白念珠菌作用100min时）白念珠菌主动外排基因CDR1、CDR2的表达水平,未发现对这两个基因的转录抑制作用。同时,菌株与若丹明6G和氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑共同孵育时,四种唑类药物均能引起若丹明6G的外排减少,提示它们与若丹明6G存在共同的药物结合位点。既然羽苔素E抑制耐药白念珠菌对若丹明6G的泵出不是依赖于外排基因的转录水平的提高,那么这种抑制作用的机制如何呢?我们进一步应用定磷法测定了羽苔素E对耐药白念珠菌CA10质膜ATPase活性的影响,结果发现羽苔素E浓度为8μg/ml、16μg/ml和32μg/ml时均能够抑制质膜ATP酶活性,减少ATP水解,从而抑制外排蛋白的泵出功能;另外,采用高效液相色谱法（HPLC）检测羽苔素E对白念珠菌耐药株中ATP泵出的影响,由于ABC转运蛋白转运底物时会泵出一定比例的ATP,而当羽苔素浓度为16μg/ml时,胞外的ATP浓度不仅未增高,反而明显低于耐药株空白组,结果间接提示羽苔素E可能不会被ABC转运蛋白泵出胞外,并且抑制了外排泵功能。在若丹明6G的泵出实验中,观察到羽苔素E与耐药白念珠菌孵育100min对耐药基因的mRNA水平无明显影响。我们进一步采用RT-PCR法考察了低浓度羽苔素E（16μg/ml）与耐药白念珠菌孵育不同的时间后主动外排基因CDR1和CDR2的表达水平。检测时间点设置了2h、6h和18h,结果显示作用时间为6h和18h时,羽苔素E均能够显著降低CDR1和CDR2的表达水平,而作用2h时,结果同前,对这两个基因的表达都无明显抑制作用。由此可知,羽苔素E对基因表达水平的影响可能是在2～6h间开始显现。综上所述,本实验研究发现羽苔素E与氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑合用后,具有较强的协同抗耐药白念珠菌作用,作用强度具有剂量依赖性,提示该化合物具有逆转唑类药物耐药的潜力;羽苔素E与唑类药物协同抗耐药白念珠菌的作用机制可能主要与抑制ABC转运蛋白ATP酶活性及降低主动外排基因CDR1和CDR2转录水平密切相关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一章 前言
• 第二章 羽苔素E与唑类药物协同抗耐药白色念珠菌作用研究
• 实验内容
• 一 棋盘法测定药物的体外抗真菌作用
• 1 材料
• 2 方法
• 二 PRMI 1460培养液中时间-杀菌曲线
• 1 材料
• 2 实验方法
• 三 YEPD培养液中生长曲线实验
• 1 材料
• 2 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三章 羽苔素E对白色念珠菌中若丹明6G转运的影响
• 实验内容
• 一 羽苔素E对白色念珠菌中若丹明6G吸收与泵出的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 二 羽苔素E对若丹明6G泵出过程中白色念珠菌CDR1和CDR2转录水平的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 三 唑类药物与若丹明6G共同作用下若丹明6G的外转运实验
• 1 材料
• 2 方法
• 实验结果
• 讨论
• 第四章 羽苔素E对白色念珠菌质膜ATP酶活性和对菌株ATP泵出的影响
• 实验内容
• 一 羽苔素E对白色念珠菌耐药株质膜ABC型-ATPase活性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 二 羽苔素E对白色念珠菌耐药株ATP泵出的影响
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 实验结果
• 讨论
• 第五章 羽苔素E对白念珠菌主动外排泵基因转录水平的影响
• 实验内容
• 1 材料
• 2 方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表