新型荧光探针的合成及其在病原微生物监测中的应用研究

论文摘要

荧光分析法因其灵敏度高、选择性好、检出限低等优点,受到越来越多研究人员的关注。其中荧光探针杂交检测技术在病原微生物检测中具有广泛的应用前景。本论文主要是合成一种新型的稀土配合物荧光探针。实验考察了稀土配合物荧光探针的发光性能和它在环境病原微生物检测中的应用。具体完成内容如下:（1）合成了四种具有长寿命荧光的稀土三元配合物:包括以噻吩甲酰三氟丙酮（TTA） , 5-氨基邻菲啰啉（5-NH2-phen）为配体的稀土铕配合物Eu（TTA）3（5-NH2-phen）;以噻吩甲酰三氟丙酮（TTA）,邻菲啰啉（phen）为配体的稀土铕配合物Eu（TTA）3phen;以1, 3-二苯基-1, 3-丙二酮（DBM）,邻菲啰啉（phen）为配体的稀土铕配合物Eu（DBM）3phen和以2-烯丙基-1,3-二苯基-1,3-丙二酮（ADBM）,邻菲啰啉（phen）为配体的稀土铕配合物Eu（ADBM）3phen。通过系统地研究四种稀土铕配合物的发光强度、荧光寿命和稳定性,选择发光性能最好的Eu（TTA）3（5-NH2-phen）作为标记探针的荧光物质。其中单分子配合物Eu（TTA）3（5-NH2-phen）的量子产率高达0.62,具有良好的光稳定性。既带有活性基团又能发长寿命荧光（荧光寿命0.68 ms）,是一种很好的荧光材料。（2）以自制合成的长寿命发光单分子Eu（TTA）3（5-NH2-phen）作为标记物,建立了一种基于两探针串联的三明治杂交检测模型。该模型包括了捕获探针DNA1,识别探针DNA2和目标探针DNA3。单分子Eu（TTA）3（5-NH2-phen）中苯环上氨基的取代使得单分子能够标记连接上寡聚核苷酸链以用于时间分辨荧光检测。我们根据文献报道,通过Primer Premier 5.0软件设计了实验所需的阴沟肠杆菌和表皮葡萄球菌的捕获探针,识别探针以及目标探针的DNA序列。实验过程中,将捕获探针DNA1共价固定在已醛基化处理的玻片上,然后与配合物Eu（TTA）3（5-NH2-phen）标记的识别探针DNA2,目标探针DNA3在玻片表面形成杂交体,在激发光激发下产生磷光信号。通过时间分辨荧光分析法检测玻片表面的荧光强度来达到检测病原微生物的目的。实验中阴沟肠杆菌纯DNA的检测限低至5×10-11 mol L-1,表皮葡萄球菌的检测限为8.0×10-10 mol L-1,表现出了较高的灵敏度和较好的选择性。事实证明,该方法是一种病原微生物检测的有效方法,可以进一步应用于实际样品中的病原微生物检测。（3）我们从纯培养的阴沟肠杆菌和表皮葡萄球菌中提取目标DNA,继续以稀土铕配合物Eu（TTA）3（5-NH2-phen）作为荧光标记物,基于两探针串联的三明治杂交检测模型对纯培养的阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌进行了检测。此外,从环境样品中提取总DNA,通过杂交检测模型初步检测环境中阴沟肠杆菌的DNA浓度。实验进一步证明了所建立的杂交检测系统具有很高的选择性和灵敏度,操作简单,标记物发光稳定等优点,在病原微生物检测中具有广泛的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图索引
• 第1章 绪论
• 1.1 荧光产生的理论基础
• 1.1.1 荧光的定义
• 1.1.2 荧光量子产率
• 1.1.3 荧光强度
• 1.1.4 荧光寿命
• 1.1.5 荧光激发光谱和发射光谱
• 1.2 荧光分析概述
• 1.2.1 荧光分析的特点
• 1.2.2 常规的荧光定量分析法
• 1.2.3 荧光分析的影响因素及注意事项
• 1.2.4 荧光分析的应用
• 1.3 荧光探针及其初步应用
• 1.4 时间分辨荧光分析技术
• 1.4.1 稀土离子配合物探针的特点
• 1.4.2 时间分辨荧光测定原理
• 1.4.3 时间分辨荧光分析技术的应用
• 1.5 环境中病原微生物的检测
• 1.5.1 传统病原微生物的检测方法
• 1.5.2 现有的病原微生物检测方法
• 1.6 本文构想
• 第2章 长寿命荧光铕配合物的合成及其发光性质
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验原料及试剂
• 2.2.3 稀土铕三元配合物的合成
• 2.3 实验结果的讨论与分析
• 2.3.1 四种稀土铕配合物的发光性能
• 3（5-NH₂-phen）的荧光寿命和稳定性'>2.3.2 配合物Eu（TTA）₃（5-NH₂-phen）的荧光寿命和稳定性
• 3（5-NH₂-phen）的发光稳定性'>2.3.3 配合物Eu（TTA）₃（5-NH₂-phen）的发光稳定性
• 2.4 结论
• 第3章 稀土铕配合物荧光探针检测环境中的病原微生物
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 实验原料及试剂
• 3.2.3 探针的设计和合成
• 3.2.4 杂交模型的建立
• 3.2.5 杂交玻片的修饰
• 1 在醛基化玻璃上固定'>3.2.6 捕获探针DNA₁在醛基化玻璃上固定
• 3（NH₂-phen）的醛基化'>3.2.7 单分子铕配合物Eu（TTA）₃（NH₂-phen）的醛基化
• 3（5-NH₂-phen）标记识别探针DNA₂'>3.2.8 Eu（TTA）₃（5-NH₂-phen）标记识别探针DNA₂
• 3.2.9 相关温度的控制
• 3.2.10 探针杂交及杂交后处理
• 3.3 实验结果的讨论与分析
• 3.3.1 检测信号强度随浓度的变化
• 3.3.2 滴加捕获探针浓度的优化
• 3.3.3 洗涤温度的优化
• 3.3.4 杂交时间的优化
• 3.3.5 检测系统的选择性能及可行性
• 3.4 结论
• 第4章 铕配合物荧光探针在环境病原微生物检测中的初步应用
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 实验试剂
• 4.2.3 阴沟肠杆菌和表皮葡萄球菌的纯培养
• 4.2.4 菌种基因组DNA 的提取与检测
• 4.2.5 杂交模型的建立
• 4.3 实验结果分析与讨论
• 4.3.1 目标DNA 的检测
• 4.3.2 杂交温度的优化
• 4.3.3 杂交时间的优化
• 4.3.4 检测系统的选择性能及可行性
• 4.4 环境样品中病原微生物的检测初探
• 4.4.1 环境样品的初处理
• 4.4.2 环境样品中目标DNA 杂交检测
• 4.5 分析和展望
• 4.6 结论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录