紫斑牡丹分生结节的诱导与培养

论文摘要

牡丹（Paeonia sect. Moutan）是原产中国的传统名花和重要的药用植物,但传统采用嫁接与分株的繁殖方法,因周期长、繁殖系数低,而无法满足种苗规模化生产的需要；杂交育种采用的播种繁殖,也因幼苗生长缓慢而育种周期太长。因此,现代组织培养技术成了克服牡丹繁殖和育种难题的重要途径而备受关注,它同时也有可能应用于药用成分的生产。理想的牡丹组织培养体系应该有较高的繁殖系数,较低的变异率,增殖过程应有利于自动化生产,由于牡丹品种的基因型多为高度杂合,其外植体还应来源于成体植株的营养体。目前牡丹组织培养尚未建立稳定高效的体系,而且其外植体来源和植株再生途径本身多存在明显的缺陷。分生结节是一种具有高度分化能力的特殊结构,特别适合用于植物的大规模营养繁殖,是一种有价值的植株再生途径。本研究以紫斑牡丹（P. rockii）为材料,从筛选基本培养基和外植体等基本培养条件入手,研究了基本培养基种类、外植体类型及接种方式、植物激素种类和浓度等多种因素对外植体褐化、愈伤组织诱导及继代培养的影响。在此基础上,诱导了紫斑牡丹分生结节发生,探讨了影响分生结节发生的因素,并研究了培养基的状态、基本成分、pH动态变化和植物激素与分生结节生长发育的关系。最后测定了紫斑牡丹分生结节中主要药用成分的含量,讨论了其在药用成分生产上的价值。主要结论如下：1.基本培养基种类和外植体类型及接种方式对紫斑牡丹外植体褐化和愈伤组织诱导有显著的影响,可以作为控制外植体褐化、提高愈伤组织诱导率的主要途径。紫斑牡丹组织培养的理想基本培养基是SH培养基,理想外植体是叶柄薄层。叶柄薄层外植体在SH培养基上培养初期几乎不发生褐化,愈伤组织诱导率可达100%。2.叶柄薄层外植体和叶片外植体对2,4-D的敏感程度不同。叶柄薄层外植体在0.1mg/L 2,4-D的培养基中愈伤率达到最高,而叶片外植体在含0.5 mg/L 2,4-D的培养基中愈伤率达到最高。2,4-D能单独促进愈伤组织的诱导和继代增殖,而且其促进作用随着浓度的继续升高逐渐达到饱和；BA单独存在时抑制外植体产生愈伤组织,但能促进愈伤组织的继代增殖。外植体类型和两种植物激素在愈伤组织诱导过程巾的作用能延续到愈伤组织继代培养中。3.紫斑牡丹分生结节是在愈伤组织的基础上诱导成功的,诱导愈伤组织的阶段称为分生结节的前诱导阶段。分生结节的诱导过程受外植体类型及取材时间、前诱导阶段的2,4-D浓度及持续时间等多种因素共同调节。在萌芽后55 d取‘高原圣火’成体植株的叶柄切成0.5 mm左右的薄层接入含有0.1-2.0 mg/L 2,4-D的SH固体培养基中进行前诱导,45 d后将愈伤组织转移到含有0.5 mg/L 2,4-D和4 mg/L BA的SH固体培养基中,继续诱导约60 d后即可得到分生结节。本研究巾分生结节的诱导率最高达到85.7%。4.紫斑牡丹分生结节能够在液体培养基中进行增殖培养。其生长发育与培养基的状态、基本成分以及pH动态变化关系密切。分生结节在固体培养基中以个体增大生长为主,偶尔会有数量增殖；而在液体培养基中以数量增殖为主,个体增大受到抑制。分生结节的生长发育能使培养基的pH发生明显变化,变化的趋势和幅度与培养基所含的激素及初始pH有关；但培养基的初始pH对分生结节的生长发育没有明显的影响。分生结节生长发育过程中液体培养基中的pH变化分为3个阶段,阶段Ⅰ的pH变化不受激素影响,阶段Ⅱ在BA的作用下pH保持稳定,阶段Ⅲ在2,4-D的作用下pH升高。植物激素在本研究对分生结节发育状态的调控作用仅限于生长量和个体大小的变化,没有观察到器官或胚胎的分化。5.紫斑牡丹分生结节中主要药用成分芍药苷和丹皮酚的含量与其发育状态有关。本实验巾固体培养基上个体增大生长的分生结节中药用成分含量与丹皮药材的主要来源‘凤丹’（P. ostii’Feng Dan’）及传统观赏牡丹（P.×suffruticosa）根皮巾的含量接近。因此分生结节培养是生产牡丹药用成分的一种有潜力的途径。本研究所建立的紫斑牡丹分生结节诱导和培养体系对进一步深入研究建立牡丹高效植株再生体系、实现药用成分高效生产、保护野生牡丹资源等都具有重要的理论价值和应用潜力。未来相关研究的重点应着眼于诱导分生结节完成器官分化,使其成为一个能够在更多的牡丹甚至芍药品种中推广的完整技术体系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 引言
• 1.1. 牡丹组织培养的进展与问题
• 1.1.1. 愈伤组织诱导和培养
• 1.1.2. 芽培养
• 1.1.3. 体细胞胚发生
• 1.1.4. 器官发生
• 1.1.5. 胚培养
• 1.2. 分生结节: 一种有价值的植株再生途径
• 1.2.1. 分生结节发生和植株再生的形态过程
• 1.2.2. 分生结节发生和植株再生的生理过程
• 1.2.3. 影响分生结节发生和不定芽分化的因素
• 1.2.4. 分生结节再生植株途径的应用前景
• 1.3. 本研究的内容、目的与意义
• 2. 基本培养条件的筛选
• 2.1. 诱导愈伤组织的基本条件及其相互关系
• 2.1.1. 材料与方法
• 2.1.2. 结果
• 2.1.3. 讨论
• 2.2. 植物激素对外植体的作用规律
• 2.2.1. 材料与方法
• 2.2.2. 结果
• 2.2.3. 讨论
• 2.3. 外植体接种方式对培养效果的影响
• 2.3.1. 材料与方法
• 2.3.2. 结果
• 2.3.3. 讨论
• 2.4. 继代培养中愈伤组织生长状态的影响因素
• 2.4.1. 材料与方法
• 2.4.2. 结果
• 2.4.3. 讨论
• 2.5. 本章小结
• 3. 紫斑牡丹分生结节的诱导
• 3.1. 紫斑牡丹分生结节的发现
• 3.1.1. 材料与方法
• 3.1.2. 结果与讨论
• 3.2. 影响紫斑牡丹分生结节发生的因素
• 3.2.1. 材料与方法
• 3.2.2. 结果与讨论
• 3.3. 本章小结
• 4. 紫斑牡丹分生结节的生长发育
• 4.1. 培养基的状态对紫斑牡丹分生结节生长发育影响
• 4.1.1. 材料与方法
• 4.1.2. 结果与讨论
• 4.2. 培养基pH与分生结节的生长发育
• 4.2.1. 材料与方法
• 4.2.2. 结果
• 4.2.3. 讨论
• 4.3. 培养基的基本成分对分生结节生长发育的影响
• 4.3.1. 材料与方法
• 4.3.2. 结果与讨论
• 4.4. 诱导分生结节分化不定芽的尝试
• 4.4.1. 材料与方法
• 4.4.2. 结果与讨论
• 4.5. 本章小结
• 5. 紫斑牡丹分生结节的主要药用成分
• 5.1. 材料与方法
• 5.1.1. 样品制备与测定
• 5.1.2. 仪器与试剂
• 5.1.3. 色谱条件
• 5.1.4. 标准曲线测定
• 5.2. 结果
• 5.2.1. 标准曲线与回归方程
• 5.2.2. 分生结节中芍药苷及丹皮酚的含量及其影响因素
• 5.3. 讨论
• 6. 结论
• 图版
• 附录
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录
• 致谢