白斑综合征病毒（WSSV）粘附蛋白及与其相互作用的对虾细胞膜蛋白定位

论文题目: 白斑综合征病毒（WSSV）粘附蛋白及与其相互作用的对虾细胞膜蛋白定位

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 梁艳

导师: 张培军,黄倢

关键词: 白斑综合征病毒,结合,粘附蛋白

文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 白斑综合征病毒（white spot syndrome, WSSV）是引起养殖对虾大规模死亡主要病毒性病原。本文定位了WSSV的4种粘附蛋白,并得到与粘附蛋白之一VP37相互作用的对虾细胞膜53 kDa蛋白,为进一步阐明WSSV致病的分子机理提供理论基础。本文首先通过地高辛（DIG）标记的WSSV与中国明对虾原代培养的多种细胞（心脏、类淋巴器官、造血组织、血细胞等）存在特异性的结合作用,证实了对虾细胞上存在WSSV的受体。再用地高辛标记的对虾血细胞膜和鳃细胞膜蛋白与印迹到硝酸纤维素膜上,通过SDS-PAGE分离的病毒蛋白结合,定位了WSSV的4种粘附蛋白,分别为:37 kDa,39 kDa,和高于97 kDa的2个蛋白。通过质谱分析获知VP 37是wsv254编码的蛋白。根据毕赤酵母的嗜性对粘附蛋白vp37基因改造后人工合成,在毕赤酵母中成功表达得到有活性的重组目的蛋白rVP37。并通过Ni2+亲和层析的作用,得到与VP37相互作用的53 kDa对虾鳃细胞膜蛋白。这一结果与2% Tween-20处理WSSV,其组份分别经过离子交换层析和凝胶过滤层析及ELISA活性验证,确定53 kDa对虾膜蛋白具有结合活性的结果相符。质谱分析推测该蛋白与ATP synthase beta subunit （Drosophila melanogaster）有较高的同源性。洗脱回收粘附蛋白之一VP 37,免疫兔子制备抗血清,能与VP 37特异性结合,同时在较高分子量范围的病毒蛋白和VP 37在抗原性上没有相似性。对VP37含有“R G D”结合结构域的9个氨基酸功能小肽（L I Q E R G D E I）人工合成后验证活性,发现“R G D”对结合活性起重要作用,但不代表VP37结合活性的全部。VP 28是WSSV囊膜的主要结构蛋白之一,本文使用表面活性剂处理得到的电泳纯VP 28,并ELISA实验验证其结合活性。结果显示VP 28不能与对虾鳃膜蛋白结合。选取凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的4种组织（鳃、血淋巴、肝胰腺、肌肉）,着重对膜蛋白的提取方法及其多肽组成进行了初步分析。确定了这几种

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 引言

第一节 白斑综合征病毒(WSSV) 蛋白质组学和分子病毒学研究

1. WSSV 主要结构和功能蛋白的研究

2. WSSV 病毒粒子提取和纯化方法

3. WSSV 基因组研究及地理株间的差异

4. 参与病毒感染过程的相关蛋白研究

第二节 白斑综合征病毒(WSSV)的研究背景

1. 发现新的对虾病毒病原

2. 人工感染克氏原螯虾,确定增殖WSSV 的动物模型

3. WSSV 病原的检测

4. WSSV 的宿主范围调查

5. 承担973 项目相关课题

5.1 病毒粒子纯化

5.2 对虾组织原代培养及结合现象观察

5.3 结合特异性分析

5.4 多种条件处理对病毒结合活性的影响

第三节 动物病毒细胞受体研究及应用

1 病毒与受体的关系

1.1 不同病毒会选择同一受体

1.2 有时同一病毒可与一个以上受体结合

1.3 不同科的病毒选择不同的受体,同一属的病毒也会选择完全不同的受体作为吸附细胞的作用位点

2 病毒与受体的相互作用启动了病毒的生命循环

2.1 病毒与受体的结合

2.2 病毒侵入宿主细胞

3 确定病毒受体的研究方法

3.1 直接观察法

3.2 分子生物学方法

4 动物病毒受体的研究应用

第二章 白斑综合征病毒(WSSV)与宿主细胞相互作用的初步研究

第一节 地高辛标记白斑综合征病毒(WSSV)及其与宿主细胞间结合现象观察

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 病毒提纯及标记

1.3 地高辛标记产量测定

1.4 地高辛标记病毒感染活性验证

1.5 对虾细胞原代培养

1.6 病毒-细胞结合现象观察

1.7 梯度稀释DIG 标记WSSV 结合试验

1.8 竞争抑制试验

1.9 WSSV 单抗抑制试验

2 结果

2.1 病毒提纯

2.2 地高辛标记病毒活性验证

2.3 地高辛标记产量测定

2.4 对虾细胞原代培养

2.5 结合现象观察

2.6 两种酶系统比较

2.7 标记病毒梯度结合反应

2.8 竞争抑制实验

2.9 WSSV 单克隆抗体抑制试验

3 讨论

第二节 WSSV 主要结构蛋白――VP28 分离及其结合活性验证

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 表面活性剂对WSSV 的作用

1.3 银染分析处理后WSSV 的SDS-PAGE

1.4 阳离子交换层析分离增溶的VP 28

1.5 鳃膜蛋白的提取

1.6 VP28 结合活性分析

2 结果

2.1 表面活性剂的分离效果

2.2 表面活性剂的最佳增溶浓度

2.3 VP28 结合活性验证

3 讨论

第三章 对虾组织膜蛋白的制备及其多肽活性

第一节 对虾组织膜蛋白的制备方法及其多肽组成的初步分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 膜组份的分离

1.3 SDS-PAGE

2 结果

2.1 膜蛋白

2.2 膜蛋白提取物SDS-PAGE 及其多肽

3 讨论

第二节 对虾鳃细胞膜的层析分离组分结合活性分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 鳃膜蛋白的提取及DIG 标记

1.3 表面活性剂对鳃膜蛋白结合活性的影响

1.4 离子交换层析及活性组分样品SDS-PAGE 分析

1.5 凝胶过滤层析及活性组份样品SDS-PAGE 分析

2 结果

2.1 表面活性剂对虾膜蛋白活性的影响

2.2 离子交换层析得到的对虾鳃膜蛋白活性组份

2.3 凝胶过滤层析得到的对虾鳃膜蛋白活性组份

2.4 分子量约为53 kDa 蛋白是具有与WSSV 结合活性的蛋白

3 讨论

第三节 对虾细胞膜53kDa 的肽指纹图谱分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 SDS-PAGE 分离53kDa 目的蛋白

1.3 质谱分析

2 结果

3 讨论

第四节 WSSV SDS-PAGE 图谱中常见的43kDa 蛋白的来源分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 SDS-PAGE 分离待分析43 kDa 目的蛋白

1.3 分析过程

2 结果

3 讨论

第四章 4 种白斑综合征病毒(WSSV)蛋白与对虾膜蛋白粘附

第一节 WSSV 粘附蛋白的定位

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 WSSV 病毒粒子的纯化

1.3 地高辛标记对虾血细胞及鳃细胞膜蛋白的制备

1.4 Western 印迹结合实验

2 结果

2.1 蛋白覆盖印迹结合试验定位WSSV 的4 种粘附蛋白

3 讨论

第二节 WSSV 粘附蛋白VP37 的鉴定分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 WSSV 的提取

1.3 VP 37 蛋白洗脱回收

1.4 粗制膜组份的分离及地高辛(DIG) 标记

1.5 洗脱回收VP 37 结合力验证

1.6 质谱分析

1.7 VP 37 多抗的制备

1.8 多抗的特异性检测

1.9 VP 37 多抗与WSSV 高分子量蛋白的交叉反应

2. 结果

2.1 锌(E-ZincTM)染色

2.2 洗脱回收VP 37 结合力验证

2.3 质谱分析

2.4 VP 37 多抗的特异性及与WSSV 高分子量蛋白的交叉反应

3 讨论

第三节 VP37 功能小肽人工合成及活性验证

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 含有“RGD”位点的VP 37 功能小肽人工合成

1.3 竞争ELISA 验证VP 37 功能小肽的活性

1.4 表达VP 37 与VP 37 功能小肽活性比较

2 结果

2.1 VP 37 功能小肽的人工合成

2.2 竞争ELISA 验证VP 37 功能小肽结合活性

2.3 rVP 37 和其功能小肽结合活性比较

3 讨论

第五章 改造rvp 37 基因的毕赤酵母表达及活性分析

第一节 vp 37 基因改造及人工合成

1. vp37 基因改造

1.1 针对毕赤酵母偏好密码子的vp 37 基因改造

1.2 针对碱基含量的vp 37 基因改造

1.3 vp 37 基因的酶切位点改造

1.4 mRNA 二级结构分析

1.5 vp 37 基因的星号活性分析

1.6 vp 37 基因内含子分析及改造

2. 改造后rvp 37 基因的基本特征验证

2.1 G+C 含量

2.2 改造前后氨基酸序列验证

3. 讨论

第二节 rvp37 毕赤酵母高表达克隆筛选

1. 材料和方法

1.1 材料

1.2 500μg/mL ZocinTM 高抗性筛选

1.3 高表达克隆的快速筛选

1.4 高表达克隆的鉴定

2 结果

2.1 高表达克隆快速筛选

2.2 显色印迹斑分析

2.3 SDS-PAGE 鉴定分析

3 讨论

第三节 表达rVP37 蛋白活性分析及纯化

1. 材料和方法

1.1 材料

1.2 重组VP 37 的摇瓶发酵及硫酸铵沉淀

1.3 ELISA 方法检测重组改造rVP 37 活性

1.4 Ni2+ 亲和层析纯化重组目的蛋白

2. 结果

2.1 重组目的蛋白活性检测

2.2 Ni2+亲和层析纯化重组目的蛋白

3. 讨论

第四节 与VP37 相互作用的对虾鳃细胞膜蛋白定位

1. 材料和方法

1.1 材料

1.2 Ni~(2+) 亲和层析分离WSSV 相互作用的对虾细胞膜蛋白

2. 结果

3. 讨论

结论

本文所使用的仪器设备列表

参考文献

发表文章目录

致谢

发布时间: 2006-04-28

参考文献

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• [2].对虾白斑症病毒快速检测试剂盒的研制及其应用[D]. 王晓洁.中国海洋大学2005
• [3].应用噬菌体展示技术对对虾白斑综合症病毒（WSSV）中和抗体及感染相关蛋白的研究[D]. 袁丽.中国科学院研究生院（水生生物研究所）2006
• [4].对虾白斑病毒（WSSV）囊膜蛋白蛋黄抗体及凋亡抑制基因ORF390R的研究[D]. 王志民.武汉大学2004
• [5].用单克隆抗体研究对虾白斑症病毒（WSSV）的黏附蛋白[D]. 姜有声.中国海洋大学2006
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