PPARγ激动剂抑制人Tenon’s囊成纤维细胞增殖及TGF-β2诱导细胞外基质合成的研究

论文摘要

研究目的青光眼（Glaucoma）是一组以眼内压升高为主要表现的疾病，可导致不可逆性视神经损害，是世界范围内第二大致盲眼病。迄今为止，青光眼滤过性手术（Glaucomafiltration surgery，GFS）是目前药物无法控制的青光眼的主要治疗手段，但滤过道瘢痕化仍可导致手术失败。丝裂霉素（mitomycin C，MMC）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是临床常用的两个药物，但有很多严重的并发症。所以，在临床上迫切需要寻求一种新的、有效的、安全的、副作用小的抗青光眼滤过术后瘢痕化的药物。近几年研究表明，PPARγ在许多器官纤维化的发生路径进行调节，被认为是治疗纤维化的重要的靶点。那么，PPARγ是否同样也参与青光眼滤过术后瘢痕化的调节呢？PPARγ激动剂能否作为一种抑制青光眼滤过手术瘢痕化的新药物呢？研究方法本课题通过原代培养人Tenon’s囊成纤维细胞（human tenon’s fibroblasts，HTFs），体外研究两种不同类型的PPAR-γ配体激动剂15d-PGJ2和罗格列酮对HTFs增殖及TGF-β2诱导的细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）合成的影响，及其作用机制。1、组织块贴壁法原代培养HTFs并鉴定，免疫荧光法、RT-PCR、Western bolt检测PPARγ在HTFs细胞中的表达。2、不同浓度的PPARγ激动剂15d-PGJ2和罗格列酮体外作用于HTFs细胞，（1）MTT法检测细胞增殖，台盼蓝染色检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期变化；（2）实时定量PCR、Western blot检测细胞分泌TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的表达水平。3、应用5ng/ml的TGF-β2体外刺激HTFs细胞，来模拟体内滤过术后瘢痕化的过程。（1）应用15d-PGJ2 10μM、罗格列酮20μM、GW9662 10μM分别作用于5ng/ml的TGF-β2刺激的HTFs细胞，细胞计数、RT-PCR、Western blot检测细胞增殖数目及细胞外基质α-SMA、FN、Collagen I的表达水平。（2）检测不同剂量TGF-β2刺激HTFs细胞不同时间点Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达。免疫荧光、RT-PCR、Western blot、ELISA检测5ng/ml的TGF-β2刺激的HTFs细胞Smad2/3、p-Smad2/3表达。统计学分析各组实验数据以平均值±标准差（±s）表示，采用SPSS 12.0软件分析。多组间比较采用ANOVA分析，直线Pearson相关分析，率的比较采用卡方检验，取双侧α值为0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。结果1、成功原代培养HTFs细胞，HTFs细胞呈长梭形，具有成纤维细胞的一般特性：波形蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。在HTFs细胞中，PPARγ在组织学、mRNA水平、蛋白水平均表达。2、抑制HTFs细胞的增殖和TGF-β的分泌（1）15d-PGJ2和罗格列酮均能有效的抑制HTFs细胞的增殖和干预细胞周期，并呈剂量相关性，但对细胞存活率并无影响。15d-PGJ2的药物半数致死率(IC50)为13.497/μM，罗格列酮为21.622μM。15d-PGJ2可能将细胞阻止在s期，或者延缓向G2/M期的转化。而罗格列酮则是可能将细胞阻止在G1期，延缓向s期的转化。（2）罗格列酮明显抑制HTFs细胞分泌TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 mRNA和蛋白表达，而15d-PGJ2则对TGF-β分泌没有明显影响。3、抑制TGF-β2诱导的HTFs细胞增殖和细胞外基质的合成（1）15d-PGJ2和罗格列酮均能有效抑制TGF-β2诱导的HTFs细胞增殖和细胞外基质α-SMA、FN、Collagen I的合成。当PPARγ拮抗剂GW9662阻断PPARγ活性以后，15d-PGJ2抑制TGF-β2刺激的HTFs细胞增殖和细胞外基质α-SMA、Collagen I合成的作用被减弱，而对抑制FN的合成无影响。GW9662则可以减弱罗格列酮抑制TGF-β2刺激HTFs合成FN，Collagen I的合成，而对其抑制细胞增殖和α-sMA的合成无影响。（2）TGF-β2刺激细胞内的p-Smad2/3表达水平增高，呈剂量依赖性。15d-PGJ2、罗格列酮可以抑制TGF-β2的这种刺激作用，GW9662可以减弱15d-PGJ2对p-Smad2/3表达抑制的作用，但只能部分减弱罗格列酮的抑制作用。GW9662对TGF-β2和Smad2/3的活性无影响。结论1、PPARγ在正常人原代培养的人眼Tenon’s囊成纤维细胞中表达。2、15d-PGJ2通过将细胞阻止在S期，或者延缓向G2/M期的转化抑制HTFs细胞的增殖。而罗格列酮则是将细胞阻止在G1期，延缓向S期的转化。均呈剂量依赖性，并且无明显的细胞毒性。3、罗格列酮能够抑制HTFs细胞分泌TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 mRNA和蛋白表达，而15d-PGJ2则对TGF-β分泌没有明显影响。4、15d-PGJ2和罗格列酮均能有效的抑制TGF-β2诱导的HTFs细胞增殖和细胞外基质的合成，抑制作用一部分依赖结合PPARγ，同时也有部分不依赖PPARγ。其中依赖PPArγ的作用是通过干预磷酸化smad2/3的合成来抑制TGF-β/smad通路，通过类似于PPARγ/TGF-β/Smad信号通路完成的。5、罗格列酮有心脏毒性、黄斑水肿等副作用，15d-PGJ2有希望成为一种新的抗青光眼术后瘢痕化的新药物，但尚需要进一步动物实验明确其确切的抑制效果。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 PPARγ在人Tenon’s 囊成纤维细胞中的表达
• 第一节 人眼Tenon’s 囊成纤维细胞的培养
• 材料与方法
• 结果
• 第二节 PPARγ在人Tenon’s 囊成纤维细胞中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 PPARγ激动剂对HTFs 细胞增殖及TGF-β分泌的影响
• 第一节 对人眼Tenon’s 囊成纤维细胞增殖及细胞周期的影响
• 材料与方法
• 结果
• 第二节 对HTFs 细胞分泌TGF-β的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 PPARγ激动剂对TGF-β2 诱导HTFs 细胞外基质合成的影响及可能的作用机制
• 第一节 PPARγ激动剂对TGF-β2 诱导HTFs 细胞外基质合成的影响
• 材料与方法
• 结果
• 第二节 PPARγ激动剂抑制TGF-β2 诱导HTFs 细胞外基质合成的机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一
• References
• 综述二
• 参考文献
• 学习期间发表文章及获奖情况
• 致谢