核因子-κB亚单位p65短发夹状干扰RNA对肝星状细胞凋亡的影响

论文摘要

慢性肝脏疾病是一类世界性的严重危害人类健康的主要疾病,其中肝纤维化是这个过程的中间及关键环节。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）是启动整个事件的开端,在肝纤维化过程中扮演着重要的角色,诱导活化HSC的凋亡可使肝纤维化发生逆转。越来越多的研究认为HSC活化和增殖与其凋亡受到抑制有关,而核因子-κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）与细胞凋亡关系密切。NF-κB是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的蛋白因子,由Rel蛋白家族的成员以同源或异源二聚体形式组成,目前发现的哺乳动物的Rel蛋白包括p65 （RelA, NF-κB3）、p50 （NF-κB1）、Rel （c-Rel）、RelB和p52 （NF-κB2）,其中p65/p50是发现最早的,分布最广泛,主要发挥生理作用的NF-κB。NF-κB能与多种细胞基因启动子或增强子序列特定位点发生特异性结合而促进转录和表达,与炎症反应、免疫应答以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的病理生理过程密切相关。近年RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术的出现为抑制NF-κB的基因表达开辟了新的途径。RNA干扰是指将与内源性mRNA互补的双链RNA导入细胞后,引起该mRNA特异性降解,导致mRNA编码的基因不能表达,发生基因沉默,提示我们可以通过RNA干扰技术沉默NF-κB的基因表达,从而使HSC的凋亡增加,减缓肝纤维化的进程。目的:本实验通过设计短发夹状干扰RNA（short hairpin RNA, shRNA）对NF-κBp65进行基因干扰,研究其对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）激活的肝星状细胞凋亡的影响。方法:体外培养大鼠肝星状细胞,进行以下分组:①空白对照组;②LPS组:经LPS处理;③阴性组:经阴性干扰RNA与LPS处理;④阳性组:经NF-κBp65 shRNA与LPS处理;⑤脂质体2000组:经脂质体2000与LPS处理。应用western blot检测其NF-κBp65、p50及IκBα的蛋白表达,反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）检测NF-κBp65与Ⅰ型前胶原mRNA的表达,流式细胞术、末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记法（ terminal deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）检测细胞凋亡的变化,酶谱法测定明胶酶活性。结果:1 siRNA转染HSC的效率:将荧光素标记的对照siRNA转染HSC,通过荧光显微镜观察转染效率,结果显示33nmol/LsiRNA组转染72小时效率最高,可达90%以上。2 LPS激活HSC后细胞核中NF-κBp65蛋白的表达:western blot结果显示同一浓度的LPS激活HSC后,HSC细胞核中NF-κBp65蛋白表达增加,于1小时细胞核中NF-κBp65蛋白表达最高,并且浓度为1000ng/mlLPS激活HSC1小时后表达NF-κBp65蛋白增加（232.15%±5.28%）比100ng/mlLPS激活HSC后表达NF-κBp65蛋白增加（168.18%±3.39%）明显。3 NF-κBp65 shRNA基因干扰LPS激活的HSC后细胞核中NF-κBp65蛋白及mRNA的表达减低:western blot结果显示阳性组HSC细胞核中NF-κBp65蛋白的表达减低,24小时比LPS组减低72.41%±1.22%,48小时减低77.45%±1.23%,72小时减低86.34%±1.01%,于72小时减低最高,而阴性组及脂质体2000组与LPS组比较无明显减低。RT-PCR结果显示,阳性组NF-κBp65 mRNA表达明显减低,而阴性组及脂质体2000组与LPS组比较无明显减低。此结果说明实验构建了针对大鼠HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543–1561的阳性shRNA,将其转染HSC有效地干扰了NF-κBp65的mRNA及蛋白发达,并于72小时干扰效率达到最高。4 NF-κBp65 shRNA基因干扰LPS激活的HSC72小时后NF-κBp50和IκBα蛋白表达减低:western blot结果显示经阳性组HSC细胞核中NF-κBp50蛋白的表达减低,比LPS组减低75.45%±0.93%,而阴性组及脂质体2000组与LPS组比较无明显减低。阳性组细胞浆中IκBα蛋白减低,比LPS组减低70.61%±2.19%,而阴性组及脂质体2000组与LPS组比较无明显减低,说明NF-κBp65 shRNA转染HSC后,干扰NF-κBp65的mRNA及蛋白发达的同时,NF-κBp50及IκBα蛋白表达随之降低。5 NF-κBp65 shRNA基因干扰LPS激活的HSC后HSC凋亡增加:流式细胞法结果显示阳性组细胞凋亡较LPS组增加,凋亡率为15.40%±0.72%,而阴性组及脂质体2000组与LPS组比较无明显增加。TUNEL法结果显示经阳性组HSC凋亡较LPS组增加,凋亡率为33.33%±1.06%,而阴性组及脂质体2000组与LPS组比较无明显增加。6 NF-κBp65 shRNA基因干扰LPS激活的HSC后Ⅰ型前胶原mRNA表达减低:RT-PCR结果显示,经阳性组Ⅰ型前胶原mRNA表达明显减低,较LPS组减低56.84%±1.89%,而阴性组及脂质体2000组与LPS组比较无明显减低,表明经NF-κBp65 shRNA基因干扰后Ⅰ型前胶原mRNA表达减低。7 NF-κBp65 shRNA基因干扰LPS激活的HSC后明胶酶活性增高:酶谱法测定结果显示,阳性组明胶酶活性明显升高,阴性组及脂质体2000组与LPS组比较无明显变化。结论:1本实验构建了针对HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543–1561的阳性shRNA,将其转染HSC,有效地干扰了NF-κBp65的基因发达,与此同时,NF-κB p50及IκBα蛋白表达减低。2 LPS可激活HSC中NF-κBp65的表达,使其蛋白表达增多。3抑制NF-κBp65的基因发达可促进HSC的凋亡,同时Ⅰ型前胶原合成减少,明胶酶活性增强,延缓肝纤维化的发展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 核因子-κB亚单位p65短发夹状干扰RNA对肝星状细胞凋亡的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历