基因工程菌Pseudomonas sp. B3-1的构建及其产邻苯二酚发酵条件的优化

论文摘要

邻苯二酚,又名儿茶酚,是一种重要的精细化工原料,主要用于生产抗氧化剂、鞣剂、香料、染料、感光材料及橡胶等,也在农药生产和医药合成方面有应用广泛。目前应用化学合成法和直接萃取法生产邻苯二酚效益都不高。但近年来由于国内需求量急剧的增加和清洁可持续生产的需要,人们不得不研究经济有效的生产工艺,其中生物法合成邻苯二酚就是研究热点之一。本文主要利用实验室保存的一株能够降解苯甲酸钠生产邻苯二酚的野生菌株Pseudomonas sp.B-1来构建高产邻苯二酚的基因工程菌,并对工程菌产邻苯二酚的发酵条件进行了初步优化等方面的研究。根据Genbank已报道的Pseudomonas entomophila str.L48苯甲酸双加氧酶基因benA、benC和benD部分核苷酸序列设计引物,利用PCR技术从Pseudomonas sp.B-1的基因组DNA中克隆到合成邻苯二酚的基因簇PSB-AD,序列分析表明该基因簇包含4个完整的ORF,分别命名为PSB-A、PSB-B、PSB-C和PSB-D。氨基酸序列比对发现PSB-AB编码的蛋白质分别为环羟化酶的α亚基和β亚基,PSB-C编码的蛋白质为电子传递组分,环羟化酶和电子传递组分共同作用,将苯甲酸钠双加氧还原为非芳香簇顺式二醇或顺-1,2-二羟基苯甲酸。PSB-D编码的蛋白质为短链脱氢酶,能将顺-1,2-二羟基苯甲酸进一步脱氢脱还原成邻苯二酚。因此,利用PSB-AC和PSB-AD两段序列进行基因工程菌的构建。将PSB-AC、PSB-AD分别与载体pK18mob、pLAFRJ、pCM80连接,构建了6个广宿主重组质粒转入E.coli DH5α作为供体菌,以Pseudomonassp.B-1为受体菌,在含有pRK2073质粒菌株的帮助下,进行六组三亲本杂交实验,筛选到的接合子通过抗性筛选、PCR以及Southern杂交的验证,获得一株邻苯二酚产量提高的基因工程菌,命名为Pseudomonas sp.B3-1。经过比较不同生长时期工程菌与原始菌发酵液中邻苯二酚的产量发现,工程菌的邻苯二酚产量有一定的提高,36小时左右邻苯二酚产量最高为0.5mg/ml,比原始菌的产量提高了10%。最后对基因工程菌产生邻苯二酚的发酵条件进行了单因素和正交优化。结果表明,当苯甲酸钠浓度为6.0 g/L,聚蛋白胨浓度为2.0 g/L,温度为32℃以及pH值为6.0时,工程菌在200 rpm旋转摇床发酵36小时后,邻苯二酚产量达到0.7 mg/ml,比优化前提高了20%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 概述
• 1.2 苯甲酸钠及代谢途径
• 1.2.1 苯甲酸钠的特性
• 1.2.2 苯甲酸钠降解代谢途径
• 1.3 邻苯二酚
• 1.3.1 邻苯二酚的特性
• 1.3.2 国内邻苯二酚的应用进展
• 1.3.3 邻苯二酚化学合成法生产的研究现状
• 1.3.4 生物法合成邻苯二酚研究现状
• 1.3.5 合成邻苯二酚关键基因的研究
• 1.4 产邻苯二酚基因工程菌的构建研究进展
• 1.4.1 产邻苯二酚基因工程菌现状
• 1.4.2 基因工程菌的构建策略
• 1.4.3 基因工程菌的构建载体
• 1.4.4 基因工程菌构建研究中存在的问题
• 1.5 本课题研究的目的意义与方法
• 1.5.1 本课题研究的目的意义
• 1.5.2 本课题的研究方法
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 所用引物
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 培养条件
• 2.1.6 菌体保存
• 2.1.7 抗生素
• 2.1.8 溶液、缓冲液和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Pseudomonas sp.B-1基因组DNA的提取
• 2.2.2 DNA的定量方法
• 2.2.3 PCR技术克隆苯甲酸钠基因簇
• 2.2.4 纯化的PCR产物分别与克隆载体的连接
• 2.2.5 连接产物转化E.coli DH5α
• 2.2.6 转化子质粒DNA的提取
• 2.2.7 质粒和的限制性内切酶酶切验证
• 2.2.8 重组质粒的构建
• 2.2.9 Pseudomonasp sp.B3-1基因工程菌的构建
• 2.2.10 基因工程菌的验证
• 2.2.11 Southern杂交验证
• 2.2.12 邻苯二酚的测定
• 第三章 苯甲酸双加氧酶基因簇的克隆与分析
• 3.1 苯甲酸双加氧酶基因簇的克隆
• 3.1.1 Pseudomonas sp.B-1基因组DNA的提取
• 3.1.2 PCR扩增苯甲酸双加氧酶基因簇
• 3.1.3 连接、转化及酶切验证结果
• 3.2 PCR扩增产物的序列测定及分析
• 3.2.1 PCR扩增产物的序列测定
• 3.2.2 PCR扩增产物的序列分析
• 3.3 小结
• 第四章 产邻苯二酚基因工程菌的构建
• 4.1 重组质粒的构建
• 4.1.1 载体质粒
• 4.1.2 广宿主重组质粒的构建
• 4.2 基因工程菌的构建
• 4.2.1 三亲本杂交
• 4.2.2 三亲接合子的PCR验证
• 4.2.3 Southern杂交验证
• 4.3 工程菌邻苯二酚产量的测定
• 4.4 小结
• 第五章 基因工程菌Pseudomonas sp.B3-1产邻苯二酚条件的优化
• 5.1 发酵的基础培养基和培养条件
• 5.2 工程菌的生长与邻苯二酚产量的关系
• 5.3 苯甲酸钠浓度对Pseudomonas sp.B3-1产邻苯二酚的影响
• 5.4 不同氮源对Pseudomonas sp.B3-1产邻苯二酚的影响
• 5.5 聚蛋白胨浓度对Pseudomonas sp.B3-1产邻苯二酚的影响
• 5.7 PH对Pseudomonas sp.B3-1产邻苯二酚的影响
• 5.8 正交试验
• 5.9 小结
• 第六章 结论与讨论
• 6.1 结论
• 6.2 讨论
• 6.2.1 产邻苯二酚基因工程菌构建策略的选择
• 6.2.2 基因工程菌邻苯二酚产量提高不显著的原因分析
• 6.2.3 利用基因打靶技术将基因插入到受体菌中的非重要功能区
• 6.3 本研究的后续工作
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文