云芝糖肽（PSP）诱导白血病细胞凋亡中死亡受体信号调控途径的研究

论文摘要

本文对云芝糖肽（PSP）诱导人白血病细胞凋亡过程中死亡受体信号通路的调控进行了研究。采用MTT法检测了PSP对白血病细胞增殖抑制的量效关系,Annexin-V试验结合形态观察检测了凋亡的发生;流式细胞术测定了PSP对Molt-4细胞周期的影响;Western Blot和流式细胞术研究了死亡受体信号通路中的关键分子受PSP调控后的变化。结果发现云芝糖肽可抑制白血病Molt-4、Jurkat和HL-60细胞系的生长,阻滞细胞周期于S期,并诱导细胞凋亡。受试的Molt-4,HL-60,Jurkat白血病细胞中均可见凋亡酶Caspase-8激活,死亡受体Fas的表达量增加,但未见死亡受体配体TRAIL水平变化。PSP能上调Jurkat细胞中的FADD蛋白表达,但该蛋白水平的变化在Molt-4和HL-60细胞中未见。这些结果启示PSP诱导凋亡可能与死亡受体调控通路中Fas信号途径调控有关,而与TRAIL信号途径无关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 云芝糖肽简介和细胞凋亡研究进展
• 1.1 云芝糖肽的药理活性
• 1.1.1 抗肿瘤活性
• 1.1.2 抗溃疡活性
• 1.1.3 抗病毒，抗肝炎活性
• 1.1.4 云芝糖肽的镇痛作用
• 1.2 细胞凋亡与抗肿瘤药物
• 1.2.1 细胞凋亡的形态学特征
• 1.2.2 凋亡的生物化学反应
• 1.2.3 凋亡与坏死的区别
• 1.2.4 细胞凋亡的基因调节
• 1.2.5 细胞凋亡与肿瘤
• 1.3 细胞凋亡的检测方法
• 1.3.1 形态学检测方法
• 1.3.2 生物化学检测方法
• 1.3.2.1 DNA 琼脂糖凝胶电泳法
• 1.3.2.2 TUNEL
• 1.3.2.3 流式细胞术（flow cytometry, FCM）
• 1.3.2.4 细胞凋亡酶活性的检测及凋亡相关蛋白分析
• 1.4 细胞凋亡的信号传导途径
• 1.4.1 线粒体死亡途径
• 1.4.1.1 线粒体死亡信号传导机制
• 1.4.1.2 线粒体死亡信号的调节
• 1.4.2 死亡受体信号途径
• 1.4.2.1 死亡受体及死亡配体
• 1.4.2.2 死亡受体介导的信号传导机制
• 1.4.2.2.1 Fas 信号转导机制
• 1.4.2.2.2 TNFR1 信号传导途径
• 1.4.2.2.3 TRAIL 的凋亡诱发机制
• 1.4.3 线粒体通路和死亡受体通路间的“串话”
• 1.5 死亡受体/死亡配体在肿瘤临床治疗上的应用前景
• 1.6 课题的研究背景，目的、意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 云芝糖肽对白血病细胞增殖的抑制作用
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 培养基
• 2.1.1.2 药物
• 2.1.1.3 其他试剂
• 2.1.1.4 细胞株与细胞培养
• 2.1.1.5 样品预处理
• 2.1.1.6 实验仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 溶液的配制
• 2.1.2.2 接种细胞
• 2.1.2.3 药物处理
• 2.1.2.4 生长抑制率的测定
• 2.1.2.5 统计学处理
• 2.2 云芝糖肽（PSP）诱导MOLT-4，HL-60 和JURKAT 细胞凋亡的发生
• 2.2.1 材料和仪器
• 2.2.1.1 试剂
• 2.2.1.2 实验仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 普通形态学观察
• 2.2.2.2 荧光显微镜观察
• 2.2.2.2.1 溶液配制
• 2.2.2.2.2 样本制作
• 2.2.2.3 Annexin Ⅴ/PI 双染检测凋亡率
• 2.2.2.3.1 溶液配制
• 2.2.2.3.2 细胞凋亡的定量检测
• 2.2.2.4 细胞周期及凋亡峰的检测
• 2.2.2.4.1 溶液配制
• 2.2.2.4.2 流式细胞仪分析各周期细胞百分比及细胞凋亡率
• 2.3 云芝糖肽对死亡受体途径的调控研究
• 2.3.1 材料和仪器
• 2.3.1.1 试剂
• 2.3.1.2 实验仪器
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.2.1 Western blot 检测Caspase-8 的激活
• 2.3.2.1.1 溶液配制
• 2.3.2.1.2 蛋白样品制备
• 2.3.2.1.3 SDS-PAGE 凝胶电泳
• 2.3.2.1.4 Western 印迹法
• 2.3.2.1.5 免疫显色
• 2.3.2.2 Western blot 方法分析PSP 对白血病细胞Fas 蛋白及FADD 蛋白表达的影响
• 2.3.2.2.1 样品的制备
• 2.3.2.2.2 实验步骤
• 2.3.2.3 流式细胞仪检测PSP 对Fas/TRAIL 蛋白表达的影响
• 2.3.2.3.1 接种细胞
• 2.3.2.3.2 药物处理
• 2.3.2.3.3 上流式细胞仪前样品处理方法
• 2.3.2.3.4 上流式细胞仪检测
• 第三章 云芝糖肽（PSP）对MOLT-4，HL-60 和JURKAT 细胞凋亡的影响
• 3.1 云芝糖肽对白血病细胞增殖的抑制作用
• 3.1.1 实验结果
• 3.1.1.1 MTT 法测定PSP 对Jurkat 细胞增殖的抑制作用
• 3.1.1.2 MTT 法测定PSP 对Molt-4 细胞增殖的抑制作用
• 3.1.2 讨论
• 3.2 云芝糖肽（PSP）诱导MOLT-4，HL-60 和JURKAT 细胞凋亡的发生
• 3.2.1 实验结果
• 3.2.1.1 PSP 对Molt-4,HL-60,Jurkat 细胞形态学的影响
• 3.2.1.2 AnnexinⅤ/PI 双染定量检测结果
• 3.2.1.3 PSP 处理后Molt-4 细胞凋亡峰的检测
• 3.2.2 讨论
• 3.3 PSP 对MOLT-4 细胞周期的影响
• 3.3.1 流式细胞仪检测Molt-4 细胞周期实验结果
• 3.3.2 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 云芝糖肽对死亡受体途径的调控研究
• 4.1 实验结果
• 4.1.1 PSP 对Molt-4,HL-60,Jurkat 细胞Caspase-8 蛋白表达及活化的影响
• 4.1.2 Western blot 实验表明PSP 可上调Molt-4,HL-60,Jurkat 细胞Fas 蛋白的表达
• 4.1.3 PSP 对Molt-4,HL-60,Jurkat 细胞的FADD 蛋白表达的影响
• 4.1.4 流式细胞仪进一步分析验证PSP 可上调Molt-4,HL-60,Jurkat 细胞的Fas 蛋白的表达
• 4.1.5 流式细胞仪分析PSP 对Molt-4,HL-60,Jurkat 细胞TRAIL 蛋白表达的影响
• 4.2 讨论
• 4.3 小结
• 总结
• 附录
• 参考文献
• 致谢