论文摘要
目的:约90%的人脑膜瘤属于WHO I级,为生长缓慢的良性肿瘤。人脑膜瘤放疗及化疗效果欠佳,免疫疗法疗效不明确。目前,人脑膜瘤主要治疗方法是神经外科手术,但是手术后复发率仍可达到7-32%。肿瘤热疗在多种人类肿瘤治疗中的作用得到肯定,但在人脑膜瘤中尚未见系统研究报道。肿瘤热耐受的获得和细胞内多种HSPs的高表达有关。热刺激下,HSF1活化是调节多种HSPs转录的关键,而HSR1是调节HSF1三聚体活化的必要因素。HSR1 ASODN转染抑制HSF1活化,抑制多种HSPs表达,有可能改变人脑膜瘤细胞热敏感性。本研究应用了温水热疗和氧化铁磁流体热疗两种加热技术,结合了HSR1 ODN转染技术,通过对人脑膜瘤细胞热休克反应、增殖、凋亡等方面的研究,探讨应用MFH治疗脑膜瘤的可能性和优越性。方法:本实验首先建立人脑膜瘤细胞短期原代培养方法,应用免疫组织化学方法检测人脑膜瘤细胞HSF1、HSP27、HSP70和HSP90蛋白表达情况。在不同加热温度和时间下,应用免疫组织化学和western blot方法检测热刺激下HSF1、HSP27、HSP70和HSP90蛋白表达,应用MTT法检测人脑膜瘤细胞增殖抑制率。应用脂质体法和非脂质体转染载体系统——FuGENE HD转染法,将HSR1 ASODN和HSR1 SODN转染人脑膜瘤细胞。转染后分别进行温水加热实验和氧化铁磁流体加热实验,应用MTT法和多种凋亡检测方法,AO染色法、TUNNEL法和流式细胞双染法,检测人脑膜瘤细胞增殖抑制率和凋亡率以及检测HSF1、HSP27、HSP70和HSP90蛋白的变化。结果:成功进行了15例脑膜瘤短期原代培养,包括建立短期培养条件、传代方法、冻存和复苏方法和肿瘤细胞的鉴定,并发现人脑膜瘤细胞有HSF1蛋白表达,HSP27、HSP70和HSP90组成性表达水平低。在单纯温水加热（42-44℃,30-60min）和氧化铁磁流体加热（42-43℃,30min）的体外实验中,人脑膜瘤细胞HSF1表达没有明显增加,而是HSF1蛋白发生三聚体活化为主要改变方式,诱导HSP27、HSP70和HSP90在加热后24h内持续高表达,热刺激下细胞增殖没有受到影响,表明人脑膜瘤热敏感性低。单纯氧化铁磁流体44℃加热30min细胞增殖抑制率为12.62±0.78%,三次加热也不能增加这种抑制作用,而且其抑制细胞增殖的途径主要是以细胞破裂坏死为主,而未见到细胞凋亡的增加。应用脂质体法和FuGENE HD法转染HSR1 ODN至人脑膜瘤细胞内,没有影响肿瘤细胞增殖、HSF1蛋白和HSPs的表达,但是改变了人脑膜瘤细胞的热敏感性。其中,FuGENE HD转染法转染效率更高,对细胞毒性更小。体外HSR1 ASODN转染后进行加热实验中,氧化铁磁流体42.5℃加热30min和温水43℃加热30min抑制人脑膜瘤细胞HSF1蛋白活性,进而也阻断了HSP27、HSP70和HSP90的诱导表达,明显抑制人脑膜瘤细胞增殖,诱导大量细胞凋亡。结论:人脑膜瘤细胞热敏感性低,主要与热刺激下诱导型HSP27、HSP70和HSP90持续高表达有关。HSR1 ASODN转染抑制HSF1三聚体活化,抑制诱导型HSPs表达,改变了人脑膜瘤细胞热敏感性。体外实验中,氧化铁磁流体42.5℃加热30min结合HSR1 ASODN转染能通过抑制人脑膜瘤细胞HSF1蛋白活性,减少了诱导型HSPs表达后的保护修复和抗凋亡作用,增加人脑膜瘤细胞热敏性,实现了MFH明显抑制人脑膜瘤细胞生长,诱导大量细胞凋亡的治疗效果。氧化铁MFH结合HSR1反义转染基因治疗可能成为人脑膜瘤治疗的一种全新方法。创新之处:1.人脑膜瘤细胞热敏感性低,主要与热刺激下诱导型HSP27、HSP70和HSP90持续高表达有关。国内外尚未见报道。2.热刺激下,HSR1 ASODN转染抑制HSF1三聚体活化,抑制诱导型HSP27、HSP70和HSP90表达,改变了人脑膜瘤细胞热敏感性。国内外尚未见报道。3.单纯氧化铁磁流体44℃加热30min部分抑制人脑膜瘤细胞增殖能力。国内外尚未见报道。4.体外实验中,氧化铁磁流体42.5℃加热30min结合HSR1 ASODN转染能通过抑制人脑膜瘤细胞HSF1蛋白活性,阻断了HSP27、HSP70和HSP90的诱导表达,达到明显抑制肿瘤细胞增殖和诱导大量细胞凋亡的治疗效果。国内外尚未见报道。