论文摘要
目的观察VEGF-C基因下调后膀胱癌细胞株增殖和侵袭能力的改变,体外验证VEGF-C基因做为治疗靶点的可行性;应用膀胱癌细胞系T24细胞建立膀胱癌的裸鼠移植瘤模型,并观察重组质粒CRM-30-shVEGF-C对裸鼠移植瘤组织内VEGF-C表达的影响及对肿瘤的生长抑制作用,为其临床开发应用和探索肿瘤治疗的新途径提供实验和理论基础;筛选与VEGF-C相互作用的基因及可能的信号通路,探讨VEGF-C基因在膀胱癌中的作用机制。方法1、构建Ⅱ型启动子启动的新型microshRNA结构的干扰质粒CRM-30-shVEGF-C,对膀胱移行细胞癌细胞株T24和膀胱鳞癌细胞株ScaBER进行转染并建立稳定转染细胞株,应用RT-PCR、Western blot、ELISA、细胞免疫组化等方法研究干扰后细胞株VEGF-C表达水平的变化,应用MTT及细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况,用流式细胞技术研究其对细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响,应用Transwell实验和黏附实验验证其转移侵袭能力的改变。2、①以稳定转染的T24细胞株与T24细胞株进行裸鼠皮下接种,进行成瘤实验;②以瘤块皮下接种法建立裸鼠皮下膀胱肿瘤模型,成瘤后,分为四组,瘤内分次多点注射Lipofectmin2000介导的CRM-30-shVEGF-C质粒、CRM-30-non、PCDNA3.1/VEGF-C质粒和单纯的DMEM,研究VEGF-C对膀胱肿瘤的作用。治疗过程中测量肿瘤体积,计算肿瘤抑制率,并观察各组治疗后肿瘤生长情况,并绘制肿瘤生长曲线;应用RT-PCR及Western blot、免疫组化方法观察VEGF-C在mRNA及蛋白质水平表达的情况。3、利用表达谱基因芯片技术分析T24细胞VEGF-C基因下调后全基因组表达谱的变化,筛选与VEGF-C相互作用的差异基因及信号通路。结果1、干扰质粒对T24、ScaBER细胞均有较高的转染效率,在mRNA及蛋白水平均能显著降低VEGF-C的表达;干扰后,S期细胞的百分率降低,G1期的百分率升高,凋亡细胞比例明显增加;干扰质粒能显著抑制细胞增殖;干扰后,细胞的透膜率和黏附率明显降低。2、①CRM-30-shVEGF-C质粒稳定转染的T24细胞成瘤能力下降了60%②成功用细胞接种法和瘤块接种法构建了裸鼠人膀胱癌T24细胞株的动物模型,T24细胞成瘤率为88%（22/24）。③VEGF-C表达质粒PCDNA3.1/VEGF-C能促进肿瘤的生长;VEGF-C干扰质粒CRM-30-shVEGF-C能抑制肿瘤的生长,并能延缓或抑制肿瘤坏死出血的发生和荷瘤裸鼠恶液质的出现。④RT-PCR和WesternBlot结果表明与DMEM对照组相比,PCDNA3.1/VEGF-C可显著增高瘤体中VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表达;CRM-30-shVEGF-C质粒可显著降低瘤体中VEGF-C在mRNA及蛋白水平的表达。3、筛选出了1298个共同差异表达的基因,这些基因涉及到细胞周期、细胞增殖、信号转导、细胞凋亡及细胞分化等多个方面。VEGF-C基因下调后,趋化因子家族基因CXCL3、IL8、CCL20、CXCL6、CXCL1、CXCL5、CXCL2下调,趋化因子受体CCR7上调,黏附因子家族中CD44、ITGB1、ITGA2下调,ITGA4、ITGB3、ITGB4、ICAM2上调。VEGF-C的下调也与Gadd45a的下调有关。结论1、在细胞水平上证实VEGF-C基因可以作为膀胱癌基因治疗的有效靶点,为后续的以VEGF-C为靶点的膀胱癌基因治疗体内实验奠定基础。2、VEGF-C高表达能促进肿瘤生长,使肿瘤出现坏死和出血,荷瘤裸鼠出现恶液质;VEGF-C低表达则能抑制肿瘤细胞生长,延缓肿瘤出现坏死、出血以及恶液质的出现。本研究从正反两方面为以VEGF-C为靶点的肿瘤基因沉默疗法提供了可靠的理论和实验基础。3、在基因水平上证实了VEGF-C基因是影响细胞黏附和侵袭的重要因子,主要通过调控趋化因子家族基因和黏附因子家族基因而发挥作用,干扰VEGF-C后,膀胱癌通路中的许多基因均有明显改变,进一步证明VEGF-C基因是膀胱癌治疗的一个有效靶点。