Osa-miR319及Osa-miR164各前体对水稻的遗传转化及在叶形态发育作用分析

论文摘要

植物]miRNA广泛参与植物体内的调控,如发育、器官形成生物的和非生物胁迫等过程。miRNA319和miRNA164在控制植株叶的形态建成和器官边界方面起到至关重要的作用。水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRS V)侵染水稻后,水稻出现卷叶、缺刻、矮化、叶脉肿等症状。通过Northern Blot对侵染水稻齿叶矮缩病毒的日本晴的miRNA319和miRNA164的表达量进行检测,发现其表达量均上调了2.4倍。通过荧光定量PCR对]miRNA319的靶基因的表达量进行检测,感染水稻齿叶矮缩病毒的水稻相对健康的同期水稻Os01gt9660的表达量上升2倍；Os12g42190的表达量上升了1.4倍；靶基因Os03g57190、Os07g05720的表达量没有太大的变化。miRNA164的靶基因Os02g36880、Os04g38720、Os06g23650、Os06g46270、Os12g05260、Os12g41680的表达量都出现下调。其中Os12g05260的表达量只有健康水稻的0.05倍;Os06g23650、Os06g46270和Os12g41680的表达量只有健康水稻的0.25倍；Os04g38720和Os02g36880在感染水稻齿叶矮缩病毒水稻内的表达量只有健康水稻体内的0.6倍和0.4倍。利用农杆菌介导的方法获得niRNA319a和miRNA319b以及miRNA164a、miRNA164b、 miRNA164c和]miRNA 164d的转基因日本晴水稻植株。通过转基因载体nptⅡ和miRNA前体的PCR检测筛选转基因阳性植株。转miRNA319a前体的水稻出现抽穗异常。通过与同期健康水稻的比较发现]miRNA319b转基因水稻出现矮化症状,miRNA319b转基因水稻在40d时比同期的正常水稻植株矮12.8 cm,55 d时比对照组健康水稻矮12.3 cm,90 d时相比对照组健康水稻矮12.9 cm,同时其抽穗异常,种子形态出现变异。通过荧光定量PCR技术对miRNA319的靶基因Os01g59660、Os03g57190、Os07g05720、 Os12g42190和miRNA 164靶基因Os06g23650、Os06g46270、Os12g05260、Os12g41680的表达量进行相对定量,选取水稻体内表达恒定的EF作为内参。转]miRNA319a的转基因水稻OsO1g59660的表达量上升2.2倍；靶基因Os03g57190的表达量极低；Os07g05720的表达量没有太大的变化；Os12酣2190的表达量仅为健康水稻的0.2倍。转miRNA319b前体的转基因的水稻Os01g59660的表达量上升2.2倍；靶基因Os03g57190的表达量为正常水稻的0.2倍；Os07g05720的表达量没有太大的变化；Os12g42190的表达量仅为健康水稻的0.2倍。在miRNA164a、miRNA164b和1niRNA164d的转基因植株中,Os06g23650的表达量出现下调,Os06g46270的表达量出现上调,Os12g05260的表达量变化不大,Os12g41680的表达量出现上调。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 水稻齿叶矮缩病毒的研究概况
• 1.1.1 水稻锯齿叶矮缩病的发现及危害
• 1.1.2 水稻齿叶矮缩病的病害症状
• 1.1.3 RRSV的病原性质及传播介体
• 1.1.4 水稻齿叶矮缩病的防治策略
• 1.1.5 RRSV基因组结构及其蛋白功能
• 1.2 植物病毒病症状形成机制的研究进展
• 1.3 miRNA的研究概况
• 1.3.1 miRNA的发现及产生
• 1.3.2 miRNA的预测方法
• 1.3.3 miRNA在生物体内的功能
• 1.3.4 miRNA作用的机制
• 1.3.5 miRNA319和miRNA164
• 1.4 转基因技术及其应用
• 1.5 研究的目的和意义
• 2. 水稻齿叶矮缩病株miRNA319和miRNA164表达量的检测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 供试材料
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 日本晴健康水稻和日本晴齿叶矮缩病株总RNA的提取
• 2.1.2.2 日本晴水稻齿叶矮缩病株总miRNA的提取
• 2.1.2.3 总miRNA的聚丙烯酰胺电泳
• 2.1.2.4 miRNA319和miRNA164转膜
• 2.1.2.5 日本晴水稻miRNA319和miRNA164的Northern Blot
• 2.2 结果与分析
• 2.3 小结与讨论
• 3. 利用荧光定量PCR检测miRNA319和miRNA164靶基因的表达量
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 供试材料
• 3.1.1.2 主要试剂
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 本研究中所用到的引物
• 3.1.2.2 RNA的提取和质量检测
• 3.1.2.3 cDNA的合成
• 3.1.2.4 目的基因表达量的荧光定量检测
• 3.1.2.5 Real Time PCR检测健康和RRSV侵染水稻中目的基因的表达量
• 3.2 结果分析
• 3.2.1 样品中总RNA质量检测
• 3.2.2 目的基因和内参的溶解曲线
• 3.2.3 目的基因和内参基因的扩增曲线
• 3.2.4 目的基因的相对定量
• 3.3 小结与讨论
• 4. miRNA319和miRNA164各前体PCAMBIA2300-Actin-ocs（PXQ-act）的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 供试材料
• 4.1.1.2 菌株和质粒
• 4.1.1.3 主要试剂
• 4.1.1.4 PCR引物
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 miRNA319及miRNA164过表达植物载体PCAMBIA2300-Actin-ocs（PXQ-act）的构建
• 4.1.2.2 miRNA319及miRNA164重组质粒的检测
• 4.1.2.3 miRNA319及miRNA164各前体重组质粒转化农杆菌EHA105
• 4.1.2.4 miRNA319及miRNA164各前体重组子转化农杆菌EHA105阳性克隆的鉴定筛选
• 4.2 结果分析
• 4.2.1 miRNA319和miRNA164各前体pXQ植物表达载体的鉴定
• 4.2.2 miRNA319及miRNA164各前体重组子转化农杆菌EHA105阳性克隆的鉴定筛
• 4.3 小结与讨论
• 5. miRNA319和miRNA164各前体对水稻的遗传转化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 供试材料
• 5.1.1.2 主要试剂
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 转基因植株鉴定引物的设计
• 5.1.2.2 日本晴水稻愈伤的培养
• 5.1.2.3 愈伤的预培养和侵染
• 5.1.2.4 筛选与分化
• 5.1.2.5 炼苗和移栽
• 5.1.2.6 转基因植株的鉴定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 接种及继代
• 5.2.2 愈伤预培养及筛选和转基因水稻的分化、练苗及栽培
• 5.2.3 miRNA319及miRNA164各前体的转基因水稻的鉴定
• 5.3 小结与讨论
• 6. 转基因植株的表型观察及分析
• 6.1 材料及方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 供试材料
• 6.1.1.2 主要试剂
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 转基因水稻表型观察
• 6.1.2.2 转基因水稻总RNA的提取和检测
• 6.1.2.3 cDNA的合成
• 6.1.2.4 转基因水稻靶基因的荧光定量
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 转基因水稻表型分析
• 6.2.2 水稻总RNA的检测
• 6.2.3 转基因水稻miRNA319和miRNA164靶基因表达量检测
• 6.3 小结与讨论
• 小结
• 展望
• 参考文献
• 附录一 miRNA319和miRNA164靶基因检测引物
• 附录二 转基因载体图谱
• 附录三 转基因水稻培养基配方
• 附录四 总RNA质量检测
• 致谢