克氏原螯虾无脊椎动物型溶菌酶的分子克隆与功能分析

论文摘要

无脊椎动物主要依靠先天免疫系统来抵御病原的入侵。研究无脊椎动物先天免疫,特别是经济无脊椎动物的先天免疫,不仅可以丰富无脊椎动物免疫学的内容,对经济无脊椎动物养殖中的疾病防治也具有重要实际的意义。克氏原螯虾（俗称小龙虾）（Procambarus clarkii）是一种重要的淡水经济甲壳类,在一些地区已形成规模化养殖,在高温季节容易发生多种疾病,因此养殖中的疾病防治越来越引起人们的重视。另外克氏原螯虾也是一种比较好的研究甲壳纲动物先天免疫的模型,材料易得,养殖条件要求简单,所得研究结果也很容易应用到对虾养殖中。因此我们选择小龙虾进行了先天免疫研究。我们在小龙虾中得到了很多免疫相关基因,本论文主要对溶菌酶进行较系统的研究。溶菌酶是一种重要的免疫效应分子,广泛分布于多种物种中。溶菌酶有多种类型,而无脊椎动物型（invertebrate type,简称i型）溶菌酶是最近才被确定为溶菌酶家族中的一员。以前的研究表明i型可能具有胞壁酸酶活性、异肽键酶活性和不依赖于酶活性的抗菌作用。在本研究中,我们从克氏原螯虾中克隆得到了两个i型溶菌酶基因的cDNAs,命名为Pclysil和Pclysi2。序列比对的结果显示Pclysil中与胞壁酸酶活性相关的位点和与异肽键酶活性相关的位点都是缺失的,而Pclysi2中缺失了胞壁酸酶的活性位点,但是具有异肽键酶的活性位点。半定量RT-PCR和实时定量PCR的结果显示这两个基因具有类似的组织分布模式,并且两个基因都在细菌刺激后产生表达量的上调,表明这两个基因可能参与先天免疫。将这两个基因所编码的成熟肽在大肠杆菌表达系统中进行重组表达,然后通过亲和纯化得到重组蛋白,利用重组蛋白进行活性实验。酶活性的实验结果表明rPclysi1不具有胞壁酸酶活性和异肽键酶活性,但具有抗菌活性；rPclysi2不具有胞壁酸酶活性和抗菌活性,但具有异肽键酶活性。以上的实验结果说明Pclysi1和Pclysi2可能参与了在小龙虾的先天免疫,并且免疫系统中可能发挥了不同的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 综述
• 先天免疫和获得性免疫
• 第一章 无脊椎动物先天免疫系统
• 1. 模式识别受体
• 2. 细胞免疫
• 2.1 血细胞的吞噬作用
• 2.2 血细胞的粘连,结节形成和包囊作用
• 3. 体液免疫
• 3.1 血淋巴的凝结作用
• 3.2 酚氧化酶原激活系统介导的黑化作用
• 3.3 抗菌肽的产生
• 第二章 溶菌酶研究进展
• 1. 溶菌酶的分类与分布
• 1.1 c型溶菌酶
• 1.2 g型溶菌酶
• 1.3 i型溶菌酶
• 2. 溶菌酶的序列和结构
• 3. 溶菌酶的功能
• 研究的目的意义和技术路线
• 第二部分 克氏原螯虾i型溶菌酶的功能研究
• 一、前言
• 二、材料方法
• 1. 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 组织分离
• 1.3 试剂和仪器
• 2. 方法
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 第一链cDNA的合成
• 2.3 基因克隆
• 2.4 序列分析比对和进化树构建
• 2.5 半定量PCR
• 2.6 实时定量PCR
• 2.7 重组蛋白的表达
• 2.8 重组蛋白纯化
• 2.9 胞壁酸酶活性检测
• 2.10 异肽键酶活性检测
• 2.11 抗菌活性检测
• 三、实验结果
• 1. 基因克隆和序列分析
• 2. 序列比对和进化树分析
• 3. Pclysi1和Pclysi2在mRNA水平上的表达模式
• 4. 重组蛋白的表达和纯化
• 5. 胞壁酸酶活性和异肽键酶活性检测
• 6. 重组蛋白的抗菌活性检测
• 四、讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表文章
• 学位论文评阅及答辩情况表