论文摘要
目的本实验联合应用不同生长因子与血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）体外诱导骨髓间充质干细胞,探讨体外hBMSCs向神经元和多巴胺神经元分化的潜能,为其治疗PD等神经变性疾病提供理论依据。方法利用Ficoll密度梯度离心的方法与贴壁培养法联合应用,获得正常人骨髓中的单个核细胞以及对BMSCs进行纯化,用流式细胞仪（flow cytometer,FCM）测定CD29、CD44、CD166、CD14、CD34和CD45等表面抗原在BMSCs上的表达。在体外先用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）进行预诱导BMSCs后,用胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）联合诱导第3代生长良好的BMSCs向神经元分化。利用倒置显微镜观察BMSCs分化过程中细胞形态的变化;通过RT-PCR方法检测诱导前后BMSCs神经干细胞的标记物巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质细胞的特异性标记物酸性纤维蛋白（GFAP）以及多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（TH）等标志物的表达情况;利用免疫荧光法检测诱导组与对照组BMSCs的NSE、TH和GFAP蛋白表达情况。结果BMSCs经三代培养后在光镜下观察细胞形态呈均一的成纤维细胞样,经FCM检测获得较高纯度的BMSCs,其中造血干细胞的表面标志CD34和CD45不表达或低表达,而骨髓间充质干细胞的标志物CD29、CD44和CD166高表达,其阳性率可达到95%以上;在不同浓度的AngⅡ诱导2w后,倒置显微镜观察各组BMSCs形态,具有典型神经元细胞形态,大多呈双极、多极和锥形;RT-PCR方法检测Nestin、NSE、TH的基因表达量,诱导组相较于对照组,有显著性差异（P<0.05）;免疫荧光细胞化学检测结果表明诱导分化后表达NSE、Nestin、TH蛋白的细胞数明显增加（P<0.05）,但诱导前后的细胞都不表达GFAP蛋白。结论联合利用密度梯度离心法、贴壁筛选法可以获得较高纯度的BMSCs,不表达或低表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45,而骨髓间充质干细胞表面标志物CD29、CD166、CD44的表达率在95%以上;生长因子和AngⅡ联合应用可以体外诱导BMSCs分化为神经元样细胞,表达Nestin和NSE,不表达星型胶质细胞的标记物GFAP,且大部分表达多巴胺能神经元的特异标志物TH,进一步证明BMSCs成为神经系统疾病细胞治疗的种子细胞的潜能。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 血管紧张素论文; 诱导分化论文; 神经元样细胞论文; 多巴胺能神经元论文;