论文题目: 小鼠精原干细胞培养体系的优化及体外基因转移
论文类型: 博士论文
论文专业: 基础兽医学
作者: 张学明
导师: 李德雪
关键词: 小鼠,精原干细胞,体外培养,基因转移,逆转录病毒载体
文献来源: 吉林大学
发表年度: 2005
论文摘要: 系统评述了精原干细胞(SSCs)研究目前的进展,进一步优化了小鼠SSCs 的培养体系,探讨了其体外转基因的方法和条件。结果表明,盘化法结合差速贴壁法比Percoll 法更适于SSCs 富集;培养液中添加表皮生长因子及雌二醇-17β对SSCs 的体外培养有良好作用。创造性地建立了稳定表达小鼠胶质细胞源神经营养因子(GDNF)的转基因STO 细胞饲养层STOGDNF,并证明其对SSCs 的体外培养有显著效果。成功构建了携带人组织纤溶酶原激活剂基因t-PA 的逆转录病毒载体PLNC-tPA、PL-tPA-SN 并获得了稳定产毒的PA317 包装细胞;以优化的培养体系为基础,用PLNC-tPA、PL-tPA-SN及真核表达载体pcDNA3-tPA以3种方式对SSCs进行体外转染,移植后初步分析认为,将SSCs 培养于STOGDNF 饲养层上,用脂质体—pcDNA3-tPA 转染或用产毒PA317 的培养上清一次性感染,均适于将外源基因导入SSCs 基因组。
论文目录:
前言
第一篇 文献综述
第一章 精原干细胞的起源、数量及生物学特性
1 SSCs 的起源
2 SSCs 的数量
3 SSCs 的生物学特性
3.1 具有发育微环境
3.2 具有自增殖潜能与分化潜能
3.3 具有较独特的形态学特征
3.4 具有不确定的细胞周期
3.5 具有迁移能力
3.6 具有特异性的分子标记
3.7 具有较特异的荧光染料染色特性
3.8 具有较高的端粒酶活性
4 结语
第二章 精原干细胞的分离富集及检测鉴定
1 生精上皮细胞悬液的获取
1.1 生精上皮细胞发育过程及特点
1.2 睾丸组织细胞的解离
1.3 生精上皮细胞的制备
2 SSCs 的分离纯化
2.1 不连续 Percoll 密度梯度离心法
2.2 单位重力沉降法
2.3 流式细胞分选术
2.4 免疫磁珠分离技术
2.5 盘化法
3 SSCs 的检测鉴定
3.1 形态学法
3.2 表面标志法或荧光染色法
3.3 综合排除法
3.4 SSCs 移植功能性检测法
第三章 精原干细胞的体外培养、建系及冷冻保存
1 SSCs 体外培养的影响因素
1.1 培养基及血清
1.2 添加剂、激素和维生素的应用
1.3 生长因子
1.4 与支持细胞共培养
1.5 饲养层细胞的利用
1.6 培养温度的确定
2 SSCs 的长期培养及建系
2.1 病毒感染法
2.2 端粒酶永生化法
2.3 正常传代法
3 SSCs 的冷冻保存
第四章 精原干细胞/睾丸组织移植及生精上皮细胞介导的转基因
1 SSCs 移植
1.1 供体和受体动物的准备
1.2 供体 SSCs 在受体睾丸内的克隆过程
1.3 SSCs 移植后克隆效率的影响因素
1.4 SSCs 移植的应用
1.5 异种(源)SSCs 移植
1.6 SSC 移植与不育及基因敲除研究
2 SSCs 介导的基因转移
2.1 体内途径
2.2 体外途径
3 睾丸组织移植
4 睾丸支持细胞介导的基因转移
5 展望
第二篇 研究内容
第一章 小鼠精原干细胞的分离富集及睾丸提取液、EGF、E2 对其体外培养的影响
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 生精上皮的消化效果
2.2 Percoll 法的分离效果
2.3 盘化法的分离效果
2.4 SSCs 的体外形态学特征
2.5 SSCs 的细胞化学及免疫细胞化学特性
2.6 不同条件下 SSCs 的存活时间及增殖行为
3 讨论
3.1 小鼠生精细胞单细胞悬液制备的影响因素
3.2 Percoll 法的分离效果
3.3 盘化法的特点及分离效果
3.4 睾丸提取液、EGF、E2 对 SSCs 体外存活及增殖能力的影响
4 小结
第二章 小鼠GDNF cDNA 在STO 细胞中的稳定表达
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 pcDNA3-mGDNF 的酶切图谱
2.2 pcDNA3-mGDNF 的序列测定
2.3 G418 对 STO 的最小致死剂量
2.4 总 RNA 提取结果
2.5 STOGDNF 的 PCR 鉴定
2.6 STOGDNF 的 RT-PCR 鉴定
2.7 STOGDNF 的免疫细胞化学鉴定
3 讨论
3.1 转染方法的选择
3.2 脂质体介导的转染的原理及效果
3.3 mGDNF cDNA 在 STO 细胞中的成功整合、转录和表达
3.4 真核基因在哺乳动物细胞中表达水平的影响因素
4 小结
第三章 STOGDNF 饲养层促进精原干细胞的体外存活和增殖
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 不同培养条件下 SSCs 的存活及增殖行为
2.2 不同培养条件下 SSCs 的数量
2.3 培养过程中 SSCs 的细胞化学和免疫细胞化学特性
3 讨论
3.1 使用饲养层的必要性
3.2 GDNF 是小鼠 SSCs 自增殖调节的关键因子之一
3.3 STOGDNF 表达产物的生物学活性及其优越性
4 小结
第四章 逆转录病毒载体 PLNC-tPA、PL-tPA-SN 的构建、包装及滴定
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 重组逆转录病毒载体 PLNC-tPA 及 PL-tPA-SN 的酶切鉴定
2.2 G418 对PA317 和NIH-3T3 的最小致死剂量
2.3 稳定产毒 PA317 细胞株的获得及病毒上清的收集
2.4 稳定产毒 PA317 细胞株培养上清中的病毒滴度
3 讨论
3.1 逆转录病毒载体的构建原理
3.2 PA317 及 NIH-3T3 的背景及特性
3.3 包装细胞的产毒效果及其影响因素
4 小结
第五章 精原干细胞的体外转染(或感染)及移植
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 腹腔注射白消胺对小鼠睾丸的影响
2.2 转染(或感染)后 SSCs 的形态学及生长行为
2.3 受体睾丸的注射效果
2.4 受体鼠的存活数及其睾丸/组织的形态学分析
2.5 受体睾丸基因组 DNA 的 PCR 结果
3 讨论
3.1 白消胺注射剂量的确定
3.2 SSCs 异体移植后的免疫排斥
3.3 SSCs 体外转染(或感染)的适宜方法
4 小结
结论
参考文献
攻博期间发表的论文及其它成果
致谢
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导师及作者简介
发布时间: 2005-08-26
参考文献
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