芽孢杆菌新型蛋白酶基因的克隆、表达及理化性质研究

论文摘要

本课题组对一株从土壤分离纯化的高产蛋白酶芽孢杆菌BLYS-1进行了深入研究，该菌所产蛋白酶对大豆蛋白具有较强的水解和脱苦作用，应用潜力较大。本研究采用同源序列法克隆了该蛋白酶基因，并在大肠杆菌BL21中进行了表达；同时对该菌的产酶条件进行了优化，采用优化的条件培养该菌后提取纯化蛋白酶，对酶的理化特性进行了研究；最后采用该菌发酵水解大豆蛋白，获得到大豆肽，并用该大豆肽喂养小鼠，考查了大豆肽对小鼠的主要生理指标的影响，研究结果如下：1.蛋白酶基因克隆及表达根据GenBank中的蛋白酶基因同源序列设计PCR引物，从芽孢杆菌BLYS-1中克隆了一个新蛋白酶基因NP。该基因与NCBI基因库中登录的枯草芽孢杆菌所产的胞外金属蛋白酶基因（GenBank：L10505.1）同源性达99.39%。以pET28a为出发质粒，构建含有NP蛋白酶基因的表达载体pET28aNP，将该表达质粒导入大肠杆菌BL21中。经50μmol/mlIPTG诱导培养，SDS-PAGE检测，结果显示NP基因在BL21中能够表达分子量大小约为30kDa的蛋白，并在干酪素培养基上培养后产生水解圈，表明该蛋白酶基因的表达产物具有水解蛋白的活性。2.芽孢杆菌发酵产酶条件优化本文对草芽孢杆菌BLYS-1产酶工艺进行了初步研究。探讨了以及碳源、糖源和无机盐等培养基的组成以及pH、温度、转速、装液量和接种量等操作条件对蛋白酶表达的影响。培养基组分优化结果显示1.0%淀粉以及1.5%玉米粉对该菌的发酵酶活影响较大。芽孢杆菌发酵条件的单因素实验表明初始pH9、装液量100ml/250ml、温度35℃、接种量8%、转速150r/min等单因子条件有利于蛋白酶产量的提高。最佳的操作条件组合为T（35℃）pH（9）装液量（100ml）接种量（8%），通过正交优化可以使发酵酶活达700U/ml。利用响应面法优化发酵产酶工艺，模拟出发酵的最高酶活力为800.650U/ml。3.蛋白酶理化性质分析提取芽孢杆菌BLYS-1蛋白酶，探讨pH值、温度、有机溶剂、金属离子、氧化剂和EDTA等对其影响。研究发现，该芽孢杆菌蛋白酶具有一定酸碱耐受性，在pH5-8时活性较高，其最适pH值约为7，最佳反应温度为40-60℃，70%饱和度的硫酸铵基本可以使其完全沉淀，并表现一定的抗氧化性。有机溶剂吐温和异丙醇、变性剂SDS、金属离子SnP2+P、CaP2+P、NiP+P对蛋白酶抑制作用较大，MgP2+P、ZnP2+P等对该酶有促进作用。以干酪素为底物，测得该酶动力学参数Km值为2.53g/L，Vmax值为6.67μg/s。4.大豆肽对小鼠生理的影响将48只健康的昆明系小老鼠分为六组,分别利用纯净水、大豆多肽液、大豆蛋白酶解液、豆浆液、大豆蛋白液及BLYS-1的大豆蛋白发酵液对其连续灌胃30天,研究每组小鼠的抗疲劳能力及其脾脏、肾脏、肝脏功能及血液特征。研究表明芽孢杆菌BLYS-1发酵型大豆肽等有利于小鼠增重,延长小鼠爬杆和游泳时间,并能提高脾脏指数和肾脏指数,增加肝脏糖原储备能力;与纯净水组相比,各种灌胃试剂在一定程度上有利于血液中乳酸脱氢酶含量的升高,而发酵型大豆肽可以使血液中血尿氮含量降低。

论文目录

• 内容摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 蛋白酶基因克隆
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 蛋白酶基因引物筛选
• 1.3.2 蛋白酶基因克隆分析
• 1.3.3 蛋白酶基因工程菌构建
• 1.4 小结
• 第二章 芽孢杆菌发酵产酶条件的优化
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果及分析
• 2.3.1 发酵培养基优化
• 2.3.2 发酵工艺单因子实验
• 2.3.3 发酵工艺正交优化
• 2.3.4 响应面法模拟发酵培养基组成
• 2.4 小结
• 第三章 蛋白酶理化性质分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 L-酪氨酸标准曲线的绘制
• 3.3.2 酶解进程曲线
• 3.3.3 硫酸铵盐析曲线
• 3.3.4 酶解最适pH 及对pH 耐受程度
• 20₂分析'>3.3.5 抗H₂0₂分析
• 3.3.6 有机溶剂对蛋白酶的影响
• 3.3.7 变性剂对蛋白酶的影响
• 3.3.8 金属离子对蛋白酶的影响
• 3.3.9 温度对蛋白酶影响
• 3.3.10 蛋白酶动力学参数的测定
• 3.4 小结
• 第四章 大豆肽对小鼠生理的影响
• 4.1 材料
• 4.2 试剂与仪器
• 4.3 实验方法
• 4.4 结果和分析
• 4.4.1 BLYS-1 大豆蛋白水解产物分析
• 4.4.2 小鼠行为学特征
• 4.4.3 小鼠体重增长情况
• 4.4.4 小鼠抗疲劳实验
• 4.4.5 小鼠肾脏脾脏肝脏指数实验
• 4.4.6 肝脏糖原含量测定
• 4.4.7 血液中LDH 和BUN 分析
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 攻读硕士学位期间获得奖励
• 缩略表