新型溶瘤腺病毒M1体内应用的效应和安全性研究及靶向性输送的探索

论文摘要

第一部分腺病毒Adv-GFP经不同给药方式进入BALB/c鼠体内后的组织分布和代谢【目的】研究重组腺病毒Adv-GFP分别经由尾静脉注射和腹膜后注射进入小鼠体内后的组织分布和代谢,以评价重组腺病毒载体与肝移植结合治疗肝癌的可行性和安全性。【方法】分别采取尾静脉注射和腹膜后注射纯化重组腺病毒Adv-GFP建立动物模型,以绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）表达作为指示观察腺病毒的组织分布,并定量分析荧光强度;用原位杂交法比较各器官的腺病毒转录水平;定量检测病毒注射后不同时间点血清和肝脏中的病毒滴度。【结果】两种不同给药方式注射Adv-GFP入小鼠体内后,在基因转录与GFP表达上均显示Adv-GFP主要分布在肝、脾、肺和肾;腹膜后注射与尾静脉注射相比,肝组织内腺病毒转录与表达明显增多（P<0.05）,而脾、肺和肾有不同程度的减弱;腹膜后注射的腺病毒亦会短时内进入体循环,但肝组织的病毒滴度在1w内的各个时间点均明显高于尾静脉途径。【结论】重组腺病毒的腹膜后注射能够优化治疗效果,并在一定程度上减少全身反应,更适于肝癌肝移植后的基因治疗。第二部分新型溶瘤腺病毒经由静脉输注后的生物学分布和动力学【目的】评价新型溶瘤腺病毒M1由静脉途径进入体内后的病毒分布、复制和代谢清除动力学,以及M1单独使用的抗肿瘤效应。【方法】建立具有高频转移特性的人胃癌裸鼠原位移植瘤动物模型;观察各处理组模型鼠的生存时间;在指定时间点处死动物,分离原发瘤及转移瘤进行病毒滴度测定;采用免疫组化和原位杂交来检测病毒的分布和活性复制;采用Western blot检测M1的靶点封闭效应。【结果】在人胃癌裸鼠原位模型上,M1经静脉输注后不仅分布于胃原发瘤,而且存在于转移灶;M1在肿瘤细胞中活性复制导致肿瘤细胞坏死和靶基因plk1表达降低;于成瘤早期（<2w）静脉内给药可以延长荷瘤鼠的生存时间（P<0.05）。【结论】溶瘤腺病毒M1的静脉内输注可以发挥溶瘤和靶向灭活plk1的双重效应,因此其单独应用时能够在原发瘤和远处转移灶有效感染复制,最终清除肿瘤病灶。第三部分人脐静脉内皮细胞的分离培养及条件复制性腺病毒对此细胞的作用研究【目的】本研究于体外分离培养人脐静脉内皮细胞,并以此为模型,探讨条件复制性腺病毒对增生期和静止期的血管内皮细胞的生长影响。【方法】脐静脉内灌注消化液分离内皮细胞,所获内皮细胞体外培养,经免疫荧光染色及扫描电镜检查,鉴定所获内皮细胞及其纯度;细胞病变实验（CPE）检测条件复制性腺病毒Adv5/dE1A-Aschk1的细胞裂解效应;四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同滴度腺病毒对血管内皮细胞的生长抑制作用;流式细胞仪分析腺病毒单用或联合放射线的细胞凋亡。【结果】血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞;血管内皮细胞与宫颈癌细胞HeLa相比,对条件复制性腺病毒Adv5/dE1A-Aschk1较耐受,500MOI的病毒滴度感染静止态内皮细胞未出现明显的裂解效应;Adv5/dE1A-Aschk1对内皮细胞的生长抑制效应随病毒滴度的增加而增强,100MOI的病毒作用96小时,增殖态内皮细胞生长受抑（22.0±2.5）%,而静止态内皮细胞为（13.0±2.3）%;Adv5/dE1A-Aschk1转染联合放射线处理下,增殖态内皮细胞（凋亡细胞达35.7%±3.0%）较静止态（23.1%±2.5%）更为敏感。【结论】体外分离的人脐静脉内皮细胞可作为探讨条件复制性腺病毒效应的模型细胞;条件复制性腺病毒Adv5/dE1A-Aschk1损伤血管内皮细胞的病毒剂量高于杀伤肿瘤细胞的有效剂量,有良好的治疗窗;增殖态血管内皮与静止态相比,更易被复制性腺病毒杀伤.第四部分新型溶瘤腺病毒M1体内应用的免疫安全性研究【目的】观察重组腺病毒载体M1经尾静脉注射和腹膜后注射及与免疫抑制疗法结合体内应用时的免疫安全性。【方法】采取尾静脉注射和腹膜后注射纯化重组腺病毒M1建立动物模型,连续给予环孢素A 7 d,取不同时间点小鼠肝组织和血清样本, HE染色观察肝脏病理反应,免疫组化方法检测肝组织腺病毒的表达情况;同时检测了肝脏局部淋巴细胞的募集情况和腺病毒特异性的细胞免疫反应。【结果】实验小鼠一般情况好,无任何全身毒性表现,伴有轻微的一过性ALT和Cr升高,常规病理检查仅发现肝组织轻微的炎症反应。腹膜后注射与尾静脉注射相比,其病毒蛋白表达较尾静脉注射组为多。加用环孢素A能显著降低腺病毒导致的ALT和Cr升高;有效提升重组腺病毒在小鼠肝脏的浓度。【结论】新型复制选择性腺病毒M1体内应用是安全的,可与免疫抑制疗法相结合提升其有效性和安全性。第五部分新型溶瘤腺病毒靶向性改造的研究【目的】探索将新型溶瘤腺病毒M1转染肿瘤抗原特异性CTL以达到有效清除肿瘤原发灶及转移病灶的新方法。【方法】构建CARex-Tat融合蛋白的真核表达系统,利用纯化的CARex-Tat融合蛋白协助腺病毒M1转染体外分离诱导出的肿瘤抗原特异性CTL。【结果】体外分离诱导出肿瘤抗原特异性CTL。构建pcDNA-CARex-Tat质粒并获得融合蛋白。在上皮细胞的病毒感染效率检测中,CARex-Tat融合蛋白可以提高腺病毒允许细胞株HeLa的转染效率（P<0.05）,随着作用时间的延长,效应愈加明显;但不能显著提高腺病毒非允许细胞株NIH-3T3的转染效率（P>0.05）。在悬浮细胞的病毒感染效率检测中,CARex-Tat融合蛋白可以提高K562细胞的腺病毒转染效率,但不能改善肿瘤抗原特异性CTL细胞的低转染效率。【结论】体外分离诱导肿瘤抗原特异性CTL是切实可行的,但利用CARex-Tat融合蛋白的介导提高腺病毒转染CTL效率的方法需进一步改进。

论文目录

• 前言
• 摘要
• Abstract
• 正文
• 第一部分 腺病毒Adv-GFP 经不同给药方式进入BALB/c 鼠体内后的组织分布和代谢
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第二部分 新型溶瘤腺病毒经由静脉输注后的生物学分布和动力学
• 1 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第三部分 人脐静脉内皮细胞的分离培养及条件复制性腺病毒对血管内皮的作用研究
• 1 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第四部分 新型溶瘤腺病毒M1 体内应用的免疫安全性研究
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第五部分 新型溶瘤腺病毒靶向性输送的研究
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间发表论文目录
• 致谢