论文摘要
背景:肾脏急性肾小管坏死（Acute tubular necrosis,ATN）是引起肾小管功能损害的常见原因,也是由此而引起肾功能衰竭的主要原因,其修复直接关系到肾脏疾病的病程和预后。急性缺血性肾损害,是急性肾小管坏死的主要病因,常常发生于肾动脉硬化、肾移植、大量出血而致休克等情况下。肾脏在发生缺血后,肾小管细胞随之发生坏死凋亡,从基底膜脱落或是分化为间充质表型,而分化后的细胞逐渐伸展并迁移至受损肾小管的基底膜处,并最终在此增殖再生而修复受损的肾小管,这就是传统的肾小管自身修复理论。但是仅仅依靠肾脏自身极其有限的修复作用是远远达不到治疗急性肾小管坏死的效果。而目前,临床上对急性肾功能衰竭的治疗仅仅是维持机体内环境的稳定,被动的等待肾脏自身的小管上皮细胞功能恢复,但由于肾小管上皮细胞的修复再生能力极其有限,从而影响了治疗效果。因此研究新的促进肾小管细胞功能恢复的方法,以提高肾脏疾病的治疗效果、缩短病程是迫切需要解决的问题。最近几年来,后肾间充质细胞（metanephric mesenchymal cells,MMCs）在肾脏修复再生中的作用越来越为肾脏病学者所关注,有研究证实在胚胎后肾间充质中存在有多能干细胞,其源自胚胎,无免疫原性或仅具极低免疫原性,是唯一分化形成肾小管上皮细胞的原始细胞。研究还发现后肾间充质细胞有能力跨越谱系界限形成组织器官功能性细胞,并表达组织器官特异性标志蛋白,这些研究结果都显示后肾间充质细胞在肾脏损伤修复中具有诸多潜在优势,很可能成为肾脏修复再生中功能性肾小管上皮细胞的重要来源,后肾间充质细胞移植治疗很可能成为改善急性肾小管坏死预后的重要方法。目的:在国外研究基础上,改良分离培养大鼠后肾间充质细胞的方法,观察细胞生物学特性,研究后肾间充质细胞对缺血再灌注大鼠损伤肾脏的防护及修复作用,并探讨其可能机制,为进一步研究后肾间充质细胞移植治疗急性肾小管损伤提供实验依据。方法:1.在解剖显微镜下显微分离孕13d（E13d）大鼠胚胎,获取胚胎后肾并去除输尿管芽,将胚胎后肾间充质组织以直接接种法进行原代培养,细胞传代纯化后以倒置显微镜观察细胞形态演变,四唑盐比色法（MTT）及5-溴脱氧尿嘧啶核苷法（BrdU）观察细胞增殖及更新能力,流式细胞仪检测细胞表面CD29, CD31, CD34, CD45, CD90, CD166分子的表达,免疫细胞技术检测细胞E-cadherin, Vimentin, Fibronectin等蛋白的表达,同时进行细胞多向诱导分化（脂肪细胞、成骨细胞）实验,分别采用油红O染色及碱性磷酸酶染色观察诱导分化情况。2.建立大鼠急性缺血再灌注肾损伤动物模型,并随机分为MMCs治疗组（MMCs）、I/R对照组（I/R）及假手术组（Sham）,治疗组经下腔静脉给予体外标记的培养未分化的后肾间充质细胞,分别于术后24h、48h、72h、96h处死大鼠检测肾功能（BUN、Scr）及肾脏病理改变,原位末端标记法（TUNEL）检测肾小管上皮细胞凋亡坏死情况,免疫组织化学染色法观察凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax表达水平,荧光显微镜观察标记的MMCs在肾组织中的分布情况。结果:1.培养的MMCs呈贴壁生长,梭形成纤维细胞样,单个核,核仁大,核浆比大,细胞增殖能力强,具有自我更新能力;流式细胞仪检测结果显示,几乎所有细胞都明显表达CD29、CD90和CD166,几乎所有细胞都不表达CD31、CD34和CD45;免疫细胞化学染色及免疫荧光检测结果显示MMCs明显表达间充质细胞标志蛋白vimentin和fibronectin,而不表达上皮细胞标志蛋白E-cadherin;MMCs在特定诱导条件下具有多向分化能力,可以向脂肪细胞、成骨细胞分化,诱导分化后的脂肪细胞油红O染色呈特异性红色,成骨细胞碱性磷酸酶染色呈阳性,并可形成钙结节。体外培养的MMCs形状均一,性状稳定,可以传多代以上而保持其原有表型不变,说明MMCs具有间充质细胞表型及干细胞特性;2. MMCs移植治疗后可以明显缓解缺血再灌注后急性肾小管损害所引起的肾功能急剧下降,明显减轻肾脏病理损害及肾小管上皮细胞凋亡坏死。血生化结果显示,MMCs组的大鼠在再灌注48h血清BUN及Scr值达到高峰,在随后的再灌注72h及96h则呈明显下降趋势,而I/R组大鼠在再灌注48h后血清BUN及Scr峰值明显高于治疗组,而且在随后的再灌注72h及96h也无明显下降趋势;肾脏病理检查结果也显示,Sham组大鼠肾脏病理无明显异常,MMCs及I/R组大鼠肾小球无明显病理改变,肾小管均出现肾小管上皮细胞水肿、坏死、脱落、管型形成等病理损害,但MMCs组大鼠肾小管损伤程度积分明显低于同时点I/R组大鼠;TUNEL结果显示MMCs组大鼠凋亡及坏死的肾小管上皮细胞数量明显低于同时点I/R组大鼠,而且免疫组织化学结果也显示,MMCs组大鼠肾脏凋亡调控蛋白Bcl-2表达明显高于同时点I/R组大鼠,而Bax表达则明显低于同时点I/R组大鼠,Bcl-2/Bax比值明显升高。3.免疫组织荧光检测结果显示,MMCs组再灌注24h大鼠肾脏局部未发现明显BrdU阳性标记细胞,在再灌注48h肾脏损伤肾小管局部偶尔可见个别散在BrdU阳性标记细胞,在再灌注72h肾脏损伤肾小管内出现较多BrdU阳性标记细胞,计数为[（59.6士6.4）/HP],再灌注96h肾组织内BrdU阳性标记细胞明显增多,为[（142.8士8.0）/HP],BrdU阳性细胞胞核呈绿色荧光,主要分布于肾脏外髓质及皮髓交界处肾小管中,肾皮质和内髓质阳性细胞很少,肾小球内则未见BrdU阳性细胞。有BrdU阳性细胞的肾小管中,小管内腔连续,无缺损。结论:1.体外培养的大鼠后肾间充质细胞具有间充质细胞表型及干细胞特性,具有多向诱导分化能力,在特定诱导分化条件下可以向脂肪细胞及成骨细胞分化。2.经静脉途径移植的大鼠后肾间充质细胞可迁移、定居于肾脏外髓质及皮髓交界处损伤的肾小管,减轻肾小管损伤,抑制小管上皮细胞凋亡,促进受损的肾小管修复,改善肾脏功能。
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