鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库的构建研究

论文摘要

禽流感（avian influenza）是由A型流感病毒引起的一种禽类感染或疾病综合症。禽流感病毒属正粘病毒科（Orthomyxoviridae）,为单股负链RNA病毒。甲型流感病毒除感染人外,还可感染猪、马、海洋哺乳动物和禽类。此病毒极易在禽鸟间散播,除可引起家禽大量死亡外,也可引起感染人的死亡。因此,禽流感病毒是一种危害禽类和人类健康的重要病原微生物。 对鸡源抗禽流感病毒抗体的研究不仅对疾病的预防和治疗有一定的作用,而且对进一步研究病毒在体内的致病机制提供了有利的工具。 我们首次运用噬菌体抗体库技术构建鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库。首先,我们从免疫鸡中提取外周血和脾脏,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA,以其为模板,采用Oligo-dT引物逆转录合成cDNA,用一组鸡IgG Fab特异性引物,通过PCR方法扩增出一组抗体轻链基因和重链Fd片段基因。将抗体轻链基因克隆入pComb3噬菌粒载体,转化大肠杆菌XLI-Blue构建了库容量为2.5×105的轻链基因抗体库,轻链基因的克隆效率约为50%。进一步将抗体重链Fd基因克隆入轻链抗体库中,转化大肠杆菌,构建了库容量为1×105的鸡源抗禽流感病毒Fab抗体库。经鉴定,抗体轻、重链基因的克隆效率为40%。经辅助噬菌体感染,得到噬菌体滴度1×1013CFU/ml的鸡源噬菌体抗体库。用固相化AIVAg,对所构建的噬菌体抗体库进行了五轮的富集,第五轮洗脱下的噬菌体较第一轮增加了100倍,含有抗体轻链基因和重链Fd基因的克隆,也由富集前的15%增至65%。挑取几个阳性克隆进行测序,获得的序列与GeneBank相应的鸡IgG基因序列具有较高的同源性。 鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库的构建成功为抗禽流感病毒特异性抗体的筛选及构建鸡源抗禽流感病毒全抗体库打下了良好的基础,并为进一步研制用于禽流感治疗和抗禽流感病毒单抗制剂奠定了基础,同时也为研究禽流感病毒的体内致病机制提供了条件。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 抗体库技术的发展历程
• 1.2 噬菌体抗体库技术优越性
• 1.3 噬菌体抗体
• 1.4 噬菌体抗体库的表达载体
• 1.4.1 λ噬菌体
• 1.4.2 丝状噬菌体
• 1.4.3 噬菌粒（Phagemid）
• 1.5 pComb3噬菌体载体系统的特点
• 1.6 噬菌体抗体库筛选技术
• 1.6.1 抗体库筛选方法
• 1.6.2 结合抗体的回收
• 1.7 噬菌体抗体库技术的应用
• 1.7.1 制备人源化抗体
• 1.7.2 应用抗体库技术改良抗体性能
• 1.8 噬菌体抗体库技术的发展前景
• 1.9 噬菌体抗体库技术面临的挑战
• 第2章 绪论
• 第3章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 抗原与单抗
• 3.1.3 工具酶和试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 主要实验仪器
• 3.1.6 引物
• 3.2 抗禽流感病毒抗体基因的扩增与鉴定
• 3.2.1 实验鸡的免疫
• 3.2.2 外周血淋巴细胞分离
• 3.2.3 总RNA提取
• 3.2.4 逆转录cDNA第一链
• 3.2.5 扩增抗体轻链基因和重链Fd基因
• 3.3 抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库构建
• 3.3.1 PCR产物纯化
• 3.3.2 载体和PCR产物酶切片段的制备
• 3.3.3 质粒DNA的提取
• 3.3.4 XLI-Blue电转化感受态菌的制备
• 3.3.5 DNA片段与载体的连接
• 3.3.6 抗体轻链基因的克隆
• 3.3.7 Fab噬菌体抗体库的构建
• 3.3.8 辅助噬菌体原种的制备和滴度测定
• 3.4 抗禽流感病毒噬菌体抗体库的鉴定
• 3.4.1 噬菌体抗体滴度的测定及酶切鉴定
• 3.4.2 噬菌体抗体库的筛选
• 3.4.3 制备鸡抗禽流感病毒噬菌体单抗
• 3.4.4 竞争ELISA法鉴定鸡抗禽流感病毒噬菌体单抗的特异性
• 3.4.5 阳性克隆的基因序列分析
• 第4章 结果
• 4.1 抗禽流感病毒抗体基因的扩增与鉴定
• 4.1.1 免疫鸡外周血抗体检测结果
• 4.1.2 RNA完整性及纯度和浓度鉴定
• 4.1.3 PCR扩增抗体Fab基因
• 4.2 抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库构建
• 4.2.1 辅助噬菌体原种的制备及滴定
• 4.2.2 抗体轻链基因的克隆
• 4.2.3 Fab噬菌体抗体库的构建
• 4.3 抗禽流感病毒噬菌体抗体库的鉴定
• 4.3.1 噬菌体抗体滴度的测定及酶切鉴定
• 4.3.2 噬菌体抗体库的筛选
• 4.3.3 抗禽流感病毒单抗的特异性鉴定
• 4.3.4 阳性克隆的基因序列分析
• 第5章 讨论
• 5.1 抗禽流感病毒抗体基因的扩增与鉴定
• 5.1.1 总RNA提取方法的探讨
• 5.1.2 目的基因的引物设计
• 5.1.3 RT-PCR反应条件的探讨
• 5.2 抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库构建
• 5.3 抗禽流感病毒噬菌体抗体库的鉴定
• 5.3.1 噬菌体抗体库的筛选
• 5.3.2 筛选阳性克隆的序列分析
• 5.3.3 抗禽流感病毒单抗的特异性鉴定
• 5.3.4 本试验的意义及存在的问题
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章及参加课题一览表
• 英文缩略词表
• 附录：试剂配方