新城疫病毒HN基因的克隆及其在CHO/dhfr-细胞中的表达

论文摘要

新城疫（ND）是一种在世界各地广泛分布的高度接触性传染病,对世界各国的养禽业均造成了重大经济损失。HN蛋白是构成新城疫病毒（NDV）囊膜上较大纤突的糖蛋白,也是病毒的重要宿主保护性抗原,在病毒吸附宿主细胞,促进F蛋白与细胞膜的融合以及病毒粒子从宿主细胞内的释放过程中均发挥重要作用。NDV的感染可被HN诱导的单克隆抗体所中和,表达了HN蛋白的重组体也能使鸡群获得保护。为了探讨HN蛋白在哺乳动物细胞中的高效、稳定表达,进一步研究NDV结构蛋白之间的相互作用,研制NDV HN蛋白单抗、进行新城疫疾病的诊断以及为研制新城疫亚单位疫苗提供实验基础。运用RT-PCR技术扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,进行HN基因的序列分析。NDV Roakin株系从美国所分离的自然流行毒株,其HN基因长1 731 bp,编码577个氨基酸。对所克隆HN基因与GenBank中发表的标准毒株（登录号AY289000）进行序列比较表明,其第10、213、1 572和1 596位碱基发生了突变,但预测的氨基酸只有其胞质区（1～26 aa）第4位的苏氨酸变成了丙氨酸,其余均为同义突变。且发生的碱基突变并不影响HN蛋白的成熟和四级结构的形成,也没有抗原位点的丢失。与国内生产疫苗的毒株—LaSota毒株序列比较发现,其HN基因序列同源性仅为96.3%,NDV HN蛋白内四股呈反向平行的6个β股区域,除β4区外,其他编码区从1个氨基酸到4个氨基酸均有不同程度的差异,抗原位点23第193位的aa残基及抗原位点4的第332位aa残基也存在差异。通过酶切、连接、转化等一系列操作先后将选择标记基因—二氢叶酸还原酶（dhfr）基因和NDV的HN基因插入到真核表达载体pCI-neo中,并分别受控于SV40早期启动子和hCMV启动子,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析鉴定所构建的重组真核表达载体。结果表明成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体pCI-HN-D,且插入的克隆基因片段方向正确,插入接头处核苷酸序列正常。将纯化后的重组质粒通过脂质体转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢（CHO/dhfr-）细胞,经氨甲喋呤三轮加压筛选获得具稳定表达HN蛋白的细胞株。以间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况,结果显示,在阳性转染组细胞中观察到特异性的亮绿色荧光;以免疫印迹检测目的蛋白的表达,阳性转染组细胞的裂解液上清经SDS-PAGE分离,并转至硝酸纤维素膜上后,结果显示与NDV阳性血清反应出现一条阳性反应带,证明HN蛋白在CHO/dhfr-细胞中成功表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 概述
• 1.2 新城疫病毒的结构及其特征
• 1.2.1 新城疫病毒的分类地位及基本形态
• 1.2.2 新城疫病毒的生物活性及理化性质
• 1.2.3 新城疫病毒的基因组结构特征
• 1.2.4 新城疫病毒的毒力基础
• 1.3 新城疫病毒 HN 蛋白研究进展
• 1.3.1 HN 蛋白的分子生物学及基本结构特点
• 1.3.2 HN 蛋白结构变异与功能的关系
• 1.4 新城疫基因工程疫苗研究进展
• 1.4.1 核酸疫苗
• 1.4.2 亚单位疫苗研究进展
• 1.4.3 活载体疫苗研究进展
• 1.4.4 以新城疫病毒为活载体构建多价疫苗
• 1.4.5 病毒样颗粒疫苗的研究
• 1.5 CHO 细胞表达系统研究进展
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 新城疫病毒HN基因的克隆及其在CHO/dhfr-细胞中的表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体、毒株及细胞株
• 2.1.2 主要仪器和设备
• 2.1.3 主要试剂与工具酶
• 2.1.4 试验中的引物
• 2.2 实验内容与方法
• 2.2.1 NDV HN 基因的克隆
• 2.2.2 新城疫病毒HN 基因真核表达载体的构建与鉴定
• 2.2.3 新城疫病毒HN 基因在CHO/dhfr-细胞中的表达
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 NDV HN 基因RT-PCR 扩增结果
• 2.3.2 HN 基因的克隆及测序分析
• 2.3.3 NDV HN 基因重组真核表达载体的构建
• 2.3.4 HN 基因在CHO/dhfr-细胞中的整合与转录
• 2.3.5 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达
• 2.3.6 western blot 检测目的蛋白的表达
• 2.4 讨论
• 2.4.1 NDV HN 基因序列分析
• 2.4.2 重组表达载体的特点
• 2.4.3 用哺乳动物细胞表达系统表达外源蛋白的优势
• 结论
• 参考文献
• 英文缩写词表
• 致谢
• 作者简介