miR-1975对宫颈癌HeLa细胞生长的影响及其靶基因研究

论文摘要

【研究目的】微小RNA（microRNA,miRNA）是一类长度约18-26nt的小分子非编码RNA,通过负性调节其靶基因的表达水平参与多种生理、病理过程。近几年的研究表明,许多miRNA具有癌基因或抑癌基因活性,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。实验室前期工作利用基因芯片技术发现在人宫颈癌HeLa细胞中过表达P53后miR-1975表达水平发生明显上调。在上述基础上,本研究旨在深入研究miR-1975对HeLa细胞生长表型的影响,进一步确定miR-1975直接作用的靶基因,从而阐明miR-1975对宫颈癌发生和发展发挥作用的可能分子机制。【方法】首先应用Real-time PCR技术检测miR-1975在过表达P53的HeLa细胞及其对照细胞中的表达水平,以验证基因芯片的检测结果。然后在HeLa细胞中过表达miR-1975,利用MTT、细胞集落形成及生长曲线实验检测细胞生长活性及增殖能力的变化。之后综合利用生物信息学方法和BLAST方法筛选出miR-1975的候选靶基因,并利用荧光报告载体实验验证miR-1975对其靶基因的直接调控作用。通过Real-time PCR和Western blot技术检测宫颈癌HeLa细胞过表达miR-1975后靶基因mRNA水平和蛋白水平的表达变化,进一步验证miR-1975对靶基因的调控作用。最后利用RNA干扰技术将靶基因的表达沉默后,通过MTT、细胞集落形成及生长曲线实验检测细胞生长活性及增殖能力的变化,进一步研究靶基因的功能。【结果】Real-time PCR结果显示,miR-1975在过表达P53的宫颈癌HeLa细胞中表达明显高于宫颈癌HeLa细胞,与基因芯片的结果一致。在宫颈癌HeLa细胞,过表达miR-1975增强其功能后,细胞活性均明显受抑制,并且集落形成能力和生长能力均明显降低。靶基因筛选结果表明,Homo sapiens hypothetical proteinLOC100292005（LOC100292005）,简称 WZ 其 CDS 区包含 miR-1975 的潜在结合位点。荧光报告载体实验表明miR-1975能够通过作用于WZ基因的CDS区的特定位点,并对其表达进行负性调节。而在miR-1975过表达的HeLa细胞中,WZ基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显下降。沉默HeLa细胞中WZ基因的表达后,细胞活性及增殖能力均明显受到抑制。【结论】miR-1975能够通过靶定WZ基因抑制HeLa细胞的增殖,起到抑癌基因的作用。WZ基因发挥癌基因的作用,参与了 HeLa细胞的生长过程。阐明miR-1975在宫颈癌细胞中的具体作用及其靶基因的研究有利于我们对宫颈癌的发生发展进行深入的理解,同时也为临床上宫颈癌的诊断和治疗提供新的方向。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、miR-1975对宫颈癌细胞的的作用研究
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 Real-time PCR验证miR-1975过表达P53后miR-1975差异性表达
• 1.2.2 pcDNA3/pri-miR-1975质粒的构建
• 1.2.3 细胞转染效率检测
• 1.2.4 Real-time PCR检测pcDNA3/pri-miR-1975质粒的有效性
• 1.2.5 miR-1975对宫颈癌细胞生长活性的影响
• 1.2.6 miR-1975对宫颈癌细胞生长能力的影响
• 1.3 讨论
• 1.3.1 miR-1975在肿瘤中的作用
• 1.3.2 miR-1975对宫颈癌HeLa细胞的表型影响
• 1.4 小结
• 二、miR-1975在宫颈癌中靶基因的确定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 EGFP荧光报告载体的构建
• 2.2.2 EGFP荧光报告载体实验验证WZ是miR-1975的直接作用靶基因
• 2.2.3 Real-Time PCR方法检测在过表达miR-1975后的宫颈癌HeLa细胞中WZ mRNA的表达水平
• 2.2.4 Western blot检测在过表达miR-1975后的宫颈癌HeLa细胞中WZ蛋白的表达水平
• 2.3 讨论
• 2.3.1 荧光报告载体实验的应用
• 2.3.2 miR-1975对靶基因WZ的负性调节作用
• 2.4 小结
• 三、靶基因WZ在宫颈癌中的作用研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 pSilencer/si-WZ质粒的构建
• 3.2.2 Western blot验证pSilencer/si-WZ质粒的有效性
• 3.2.3 MTT检测基因WZ对宫颈癌细胞生长活性的影响
• 3.2.4 细胞集落形成实验分析WZ对宫颈癌细胞集落形成能力的影响
• 3.2.5 细胞生长曲线实验分析WZ对宫颈癌细胞生长能力的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 MicroRNA与P53之间的相互作用
• 综述参考文献
• 致谢