基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测不同血清型副溶血性弧菌的应用研究

论文摘要

目的用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测29株不同血清型（O抗原）副溶血性弧菌和7株其它标准菌株,研究检测方法的准确性,重复性和特异性；对29株副溶血性弧菌的MALDI-TOF-MS检测结果进行聚类分析,研究菌株MALDI-TOF-MS型、血清型、tdh基因三者的内在联系。方法以MALDI-TOF-MS的鉴定结果准确性和鉴定分值的高低作为评判标准,摸索菌株预处理方式、菌株培养基和不同时间段、分析菌量、基质与样品的比例等因素,确定上述用于MALDI-TOF-MS分析的最佳条件；利用最佳条件,进行MALDI-TOF-MS检测方法的准确性,重复性和特异性研究；对29株副溶血性弧菌的MALDI-TOF-MS分析结果进行聚类分析,结合菌株血清型鉴定结果和tdh基因检测结果,研究菌株MALDI-TOF-MS型、血清型、tdh基因三者的内在联系。结果29株菌株均被鉴定为副溶血性弧菌且鉴定分值均在2.3分以上,与生化鉴定结果一致；重复性分析结果一致且准确；7株非副溶血性弧菌的标准菌株也被准确鉴别,显示良好的特异性；29株副溶血性弧菌主要有O1、O2、O3、O4、O8、O116种血清型。在差异水平为1.1时,MALDI-TOF-MS的聚类分析将菌株分成2个型别（M-type-Ⅰ, M-type-Ⅱ）。tdh基因的实时荧光PCR结果显示,29株实验菌株中有14株含有tdh基因,15株不含tdh基因。15株不含tdh基因的菌株均被分至M-type-Ⅰ型中,14株含tdh基因的菌株均被分至M-type-Ⅱ型中。8株O3群的菌株中,有7株含有tdh基因；M-type-Ⅰ型别中含有5株O2群菌株、5株O4群菌株、2株O1群菌株、1株O3群菌株、1株O8群菌株和1株O11群菌株,M-type-Ⅱ型别中含有7株O3群菌株、3株O4群菌株、2株O1群菌株、2株O2群菌株。结论MALDI-TOF-MS具备准确鉴定副溶血性弧菌的能力；菌株血清型与tdh基因检测结果比较显示,O3群菌株与tdh基因编码的TDH关系密切；具有tdh基因的菌株被MALDI-TOF-MS分型至同一型别,初步推测,MALDI-TOF-MS在检测副溶血性弧菌的tdh基因方面发挥作用；属于O3群的菌株与MALDI-TOF-MS聚类分型型别的对应关系比较明显,但其他血清型与MALDI-TOF-MS聚类分型的关系有待深入研究,推测MALDI-TOF-MS聚类分型可能与血清分型存在一定的联系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 食品安全与食源性致病菌
• 1.2 副溶血性弧菌及其检测技术的应用进展
• 1.2.1 副溶血性弧菌简介
• 1.2.2 副溶血性弧菌检测技术的应用进展
• 1.2.2.1 副溶血性弧菌的常规检测法
• 1.2.2.2 副溶血性弧菌的快速检测法
• 1.3 MALDI-TOF-MS检测技术简介
• 1.3.1 MALDI-TOF-MS基本原理
• 1.3.2 MALDI-TOF-MS的特点
• 1.3.3 MALDI-TOF-MS检测技术应用现状
• 1.3.3.1 MALDI-TOF-MS对食源性致病菌检测的应用现状
• 1.3.3.2 MALDI-TOF-MS在其它方面的应用现状
• 1.4 本论文研究的主要内容
• 第二章 实验材料和基本方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 实验试剂与器材
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 基本实验方法
• 2.2.1 实验菌株的培养
• 2.2.2 标准品的配制
• 2.2.3 基质的配制
• 2.2.4 实验菌株预处理
• 2.2.5 MALDI-TOF-MS鉴定
• 2.2.6 实时荧光PCR
• 2.2.6.1 实验菌株模板DNA提取
• 2.2.6.2 实时荧光PCR反应与结果判定
• 第三章 实验方法
• 3.1 适宜的菌株预处理方式选择
• 3.2 适宜的菌株培养条件选择
• 3.3 适宜菌体量的选择
• 3.4 基质与样品比例的影响性分析
• 3.5 MALDI-TOF-MS检测法准确性分析
• 3.6 MALDI-TOF-MS检测法重复性分析
• 3.7 MALDI-TOF-MS检测法特异性分析
• 3.8 实验菌株的MALDI-TOF-MS分型与血清分型和tdh基因关系比较
• 第四章 结果与分析
• 4.1 适宜预处理方式的确定
• 4.2 适宜培养条件的确定
• 4.2.1 适宜培养基的确定
• 4.2.2 适宜时间段的确定
• 4.3 适宜菌量的选择
• 4.4 基质与样品最佳比例的确证
• 4.5 MALDI-TOF-MS检测法准确性分析结果
• 4.6 MALDI-TOF-MS的重复性分析结果
• 4.7 MALDI-TOF-MS特异性分析结果
• 4.8 MALDI-TOF-MS分型与血清型和tdh基因关系分析
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 影响MALDI-TOF-MS检测的因素
• 5.2 MALDI-TOF-MS检测准确性、重复性、特异性分析讨论
• 5.3 MALDI-TOF-MS分型与其它分型技术关系的讨论
• 第六章 展望
• 6.1 本研究的特色
• 6.2 MALDI-TOF-MS检测法的不足及需要进一步开展的研究
• 参考文献
• 致谢