论文摘要
[研究背景]结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,近年来结直肠癌的发病率以及死亡率呈逐年上升趋势。目前结直肠癌发生发展的分子机制尚未完全阐明,许多结直肠癌相关基因未被发现。寻找新的结直肠癌相关的抑瘤基因或易感基因,对其功能进行研究,以期找到更多的影响结直肠癌发生发展的关键基因或比较特异的分子标志物,确定结直肠癌的遗传易感因素,阐明其发病的分子机制,对结直肠癌的诊断、预后监测以及新的抗肿瘤药物的研制都具有重要意义。NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位侯选克隆策略克隆的一个抑癌基因（基因登陆号：AF188239）,定位于染色体9p13.3区域。它在结直肠癌细胞和组织中表达下调。前期研究表明：NGX6能通过抑制核内β-catenin的表达负调控Wnt/β-catenin通路,通过抑制P-JNK核移位负调控SPAK/JNK通路,并下调EGFR-PKC-IKK-NF-κB通路的关键分子和转录因子。过表达NGX6基因可以抑制结肠癌细胞增殖和细胞周期进程,抑制肿瘤血管的生成；降低肿瘤细胞体外侵袭能力,同时恢复肿瘤细胞间隙通讯。为了揭示NGX6基因在结直肠癌细胞和组织中表达下调的分子机制,本课题组前期对NGX6基因的转录调控区进行了初步研究。以NGX6基因mRNA的第一个碱基定义为+1,利用生物信息学分析技术、缺失突变体报告质粒构建技术以及荧光素酶活性分析系统,定位了NGX6基因的近距离启动子区-159/+276,并发现NGX6基因启动子区存在一个大小为约400bp的CpG岛。本课题在前期工作的基础上,对NGX6基因转录调控进行深入研究,希望从调控该基因表达的上游基因的角度,明确该基因具体的表达调控机制,以进一步揭示NGX6基因在肿瘤的增殖、侵袭、转移中的分子机制,深入阐明NGX6基因的生物学功能。[NGX6基因启动子的精细定位]在前期的研究工作中,我们成功克隆并鉴定了NGX6基因启动子,并将NGX6基因的近距离启动子区定位于-159/+276的区域。为了进一步获得NGX6基因的最小启动子序列,依据MatInspector软件分析结果,分别在其近距离启动子片段-159/+276的5’或3’进行缺失不同长度的部分序列,构建了五个缺失突变报告质粒：pGL3 -159/+100、pGL3 +100/+276、pGL3-159/-86、pGL3 -86/+12和pGL3+12/+100。将它们分别转染不同细胞系中,采用荧光素酶活性检测和绿色荧光蛋白活体检测法发现NGX6基因-86/+100的长度为186 bp的区域为其最小启动子区。[NGX6基因启动子顺式作用元件和反式作用因子的鉴定和功能研究]真核基因表达调控体系中最关键的是转录起始水平的调控,其基本机制主要包括顺式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶三者之间的相互协同作用,其实质是蛋白质与DNA、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。在线软件MatInspector分析结果表明,NGX6基因启动子区为一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区。它含有多种转录因子结合位点,如：Sp1、Egr-1、NF-Y、P53、MYC-MAX和AP2等。凝胶电泳迁移率（EMSA）证实了NGX6基因启动子区的Sp1（-17/+5）、NF-Y（-36/-18）以及Sp1/Egr（-54/-39）结合位点。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证实了转录因子Spl和Egr-1与NGX6基因启动子的特异牲结合。本课题组成功构建了核转录因子Egr-1和Spl真核表达载体。利用转基因技术,过表达Egr-1能增强NGX6基因启动子活性并上调NGX6基因的内源性mRNA表达；而封闭内源性Egr-1的表达则抑制了NGX6基因内源性mRNA的表达水平。此外,Erk1/2激酶的抑制剂PD98059可以明显下调结肠癌细胞中Egr-1和NGX6表达水平,EMSA实验证实PD98059可能通过降低细胞核内Egr-1蛋白与DNA的结合活性,进而抑制了NGX6基因的表达。这些结果说明,核转录因子Egr-1是正性调控NGX6基因的转录表达。过表达转录因子Spl能在结肠癌细胞中上调NGX6基因启动子活性；封闭内源性Spl的表达可以明显上调NGX6基因内源性mRNA的表达水平。这些结果说明核转录因子Spl也是正性调控NGX6基因的转录表达。[DNA甲基化抑制NGX6基因的表达,去甲基化能恢复其表达]在前期研究中,利用CpGplot和CpGFinder程序在线扫描NGX6的转录调控区,发现NGX6的启动子区-107/+310存在一个CpG岛。Refgene数据库中也搜索到在NGX6基因的转录调控区存在CG频率较高的区域。利用Methylator软件（http://bio.dfci.harvard.edu/Methylator/）对NGX6启动子区进行了预测分析。分析结果显示在NGX6基因的启动子区域存在多个甲基化位点,提示NGX6基因启动子区的这一CpG岛可能是其启动子活性调节的重要调控元件。利用NGX6基因启动子区特异性甲基化和非甲基化引物进行了甲基化特异性聚合酶链反应,发现NGX6启动子在三株结肠癌细胞系中都呈部分甲基化状态。进一步在结直肠癌组织水平上进行了检测,结果显示NGX6启动子在40例结直肠癌组织中的甲基化水平明显高于40例正常结直肠组织（P<0.05）。将结直肠癌组织中NGX6基因启动子的甲基化状态与结直肠癌临床病例特征进行相关性分析,发现在结直肠癌组织中,NGX6基因启动子甲基化频率与患者的年龄相关（P<0.05）；NGX6基因启动子甲基化频率与结直肠转移具有相关性趋势（P=0.056）；而与患者的性别、Duke’s分期、肿瘤部位无明显相关（P>0.05）。亚硫酸盐修饰后测序法的结果表明NGX6基因启动子-233/+150存在多个甲基化位点,其中涉及-54/-39的Spl与Egr-1重叠结合位点,两个位于-17/+5的Spl结合位点。利用SssI甲基转移酶能将腺苷甲硫氨酸中的甲基转移至基因组DNA的CpG位点的非甲基化胞嘧啶“C”上,使原本未甲基化的“C”发生甲基化的特点,选择性地处理了对NGX6基因启动子活性调节起重要作用的Sp1/Egr-1重叠结合位点-54/-39的生物素标记的双链寡核苷酸探针,并进行了凝胶电泳迁移率实验。发现在Spl/Egr-1重叠结合位点DNA甲基化完全抑制了Egr-1核蛋白与DNA的结合,部分抑制了Spl核蛋白与DNA的结合。同样,将NGX6基因启动子荧光素酶报告质粒pGL3-159/+100和绿色荧光蛋白报告质粒pGL3-159/+100/GFP经SssI甲基转移酶处理后,发现他们在结肠癌细胞中丧失了启动子活性。2.5μM的甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷能够逆转NGX6基因启动子在HT-29细胞的甲基化状态,并上调NGX6基因mRNA表达水平。总之,通过本课题研究,我们获得了NGX6基因启动子的精细位置,较系统地阐述了NGX6启动子顺式作用元件和反式作用因子的组成和功能,探索了DNA甲基化对NGX6基因启动子活性、mRNA表达水平的影响及分子机制,并发现NGX6基因启动子区DNA甲基化参与NGX6基因在结直肠组织的转录调控,且NGX6基因启动子区高甲基化状态可能成为结直肠癌的一个潜在分子靶标。这些研究结果将有助于全面了解NGX6基因的生物学功能,明确NGX6基因在结肠癌侵袭、转移中的作用机制,为其潜在的临床应用提供科学的理论和实验依据。
论文目录
相关论文文献
- [1].NGX6基因联合顺铂治疗肺癌的体内外研究[J]. 中国生化药物杂志 2015(05)
- [2].肝细胞癌中NGX6表达与超声造影特征的关系[J]. 中国肿瘤临床 2008(21)
- [3].NGX6基因在肝细胞癌中的表达及意义[J]. 中南大学学报(医学版) 2008(10)
- [4].NGX6基因两转录本在不同分期结直肠癌中的表达及与癌胚抗原的关系(英文)[J]. 中南大学学报(医学版) 2010(05)
- [5].抑瘤基因NGX6启动子的克隆与功能鉴定[J]. 生物化学与生物物理进展 2010(10)
- [6].NGX6基因在结直肠癌中的表达及其与微卫星不稳定的关系[J]. 结直肠肛门外科 2012(01)
- [7].NGX6、TUSC4基因与大肠癌的发生发展研究进展[J]. 实用医院临床杂志 2012(05)
- [8].结肠癌中NGX6抑制EGFR/K-ras/JNK/c-Jun/cyclin D1信号通路的研究[J]. 生物化学与生物物理进展 2008(05)
- [9].NGX6、p21WAF1在结直肠癌中的表达及意义[J]. 现代实用医学 2012(07)
- [10].抑瘤基因NGX6对结肠癌血管形成的影响[J]. 世界华人消化杂志 2009(25)
- [11].NGX6基因联用5-Fu对人结肠癌细胞凋亡的影响[J]. 中国肿瘤临床 2009(21)
- [12].抑瘤基因NGX6对人结肠癌细胞凋亡的影响[J]. 生物化学与生物物理进展 2008(10)
- [13].胃癌组织NGX6和Cyclin D1表达及其生物学意义的探讨[J]. 中华肿瘤防治杂志 2012(08)
- [14].BRD7、NGX6基因在急性白血病中的表达[J]. 肿瘤防治研究 2008(09)
- [15].NGX6与IL-17F在大肠癌及大肠腺瘤中的表达及其与VEGF的相关性分析[J]. 癌症进展 2018(06)
- [16].NGX6和CyclinD1蛋白在食管鳞癌组织中的表达及意义[J]. 中国癌症杂志 2010(12)
- [17].NGX6转染鼻咽癌细胞对表达血管内皮生长因子-C的影响[J]. 医学研究生学报 2010(07)