酿酒酵母PKA催化亚基的活性比较研究

论文摘要

酿酒酵母的Ras-cAMP信号通路在调控酵母细胞代谢、增殖、分化、压力抗性以及菌丝生长过程中具有重要的作用。蛋白激酶A（PKA）是Ras-cAMP信号通路的主要靶标。PKA催化亚基由基因TPK1、TPK2和TPK3编码,二聚体调节亚基由BCY1基因编码。cAMP和PKA的调节亚基结合,释放出其催化亚基而激活了PKA。PKA通过负调控锌指蛋白转录因子Msn2/4和蛋白激酶Rim15来调节细胞对压力的响应。PKA活性高的细胞对热敏感,而PKA活性低的细胞对热有抗性。Yak1处于PKA的下游,受PKA的负调控作用,对细胞的生长有抑制作用。缺失YAK1基因能提高PKA活性。三个TPK基因有靶标特异性,但它们在PKA活性方面有什么差异还不清楚。本文构建了缺失一个TPK基因或缺失两个TPK基因的菌株,对它们的热击抗性进行比较研究。实验结果表明,不同TPK基因表达产物的协同作用产生的PKA活性不同。在YAK1基因缺失背景下,TPK2基因表达产物的PKA活性最高,TPK3基因表达产物的PKA活性最低;而在BCY1基因缺失背景下,TPK基因表达产物的PKA的活性顺序相反。同时还可以推测,YAK1基因表达产物对于压力抗性系统是必要的,而TPK3基因表达产物对压力抗性系统有正调控作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 细胞信号转导概述
• 1.2 酿酒酵母的Ras-cAMP信号通路
• 1.3 Ras-cAMP信号通路的主要元件
• 1.3.1 鸟苷酸交换因子Cdc25 和Sdc25
• 1.3.2 酵母的小G蛋白Ras
• 1.3.3 Ras蛋白的GTP酶激活蛋白Ira1 和Ira2
• 1.3.4 腺苷环化酶 Cdc35/Cyr1 和腺苷酸环化酶相关蛋白 Cap/Srv
• 1.3.5 cAMP磷酸二酯酶Pde1 和Pde2
• 1.3.6 G 蛋白偶联的受体体系 GPCR（Gpr1-Gpa2）
• 1.3.7 Ras-cAMP通路的主要靶标是蛋白激酶A（PKA）
• 1.3.8 激活压力响应基因的锌指蛋白Msn2 和Msn4
• 0期的蛋白激酶Rim15'>1.3.9 调控细胞进入G₀期的蛋白激酶Rim15
• 1.3.10 调控PDS作用元件锌指蛋白 Gis1
• 1.3.11 双特异性蛋白激酶Yak1
• 1.3.12 ZDS1
• 1.4 酵母中的压力响应
• 1.5 本文的主要研究内容
• 第二章 实验材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 酶制剂
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR反应
• 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.3 大肠杆菌转化
• 2.2.4 小规模质粒的快速提取（CTAB法）
• 2.2.5 限制性内切酶酶切体系
• 2.2.6 DNA片段的回收纯化
• 2.2.7 DNA连接体系
• 2.2.8 酵母细胞的转化
• 2.2.9 酵母染色体的快速提取
• 2.2.10 酵母等位基因的分离及遗传分析
• 2.2.11 不同交配型酵母细胞之间的杂交
• 2.2.12 产孢及四分体孢子拆分
• 2.2.13 Dilution 实验方法
• 2.2.14 水浴热击实验
• 2.2.15 平板计数计算细胞存活率
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 菌株构建
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 两个TPK基因产物协同作用活性比较
• 3.2.2 TPK3 基因表达产物在压力抗性系统中功能研究
• 3.2.3 TPK1，TPK2 和TPK3 基因表达产物的PKA活性差异研究
• 第四章 总结与展望
• 4.1 工作总结
• 4.2 工作展望
• 参考文献
• 致谢