人类胚胎干细胞诱导分化为多巴胺能神经元的实验研究

论文摘要

【目的】建立体外诱导人的胚胎干细胞（hESCs）分化为多巴胺能神经元的条件,以期在培养系统中获得更多的较纯的、具有功能的多巴胺能神经元,为细胞移植治疗帕金森病的研究开辟新的前景。【方法】将hESCs置于小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上培养,细胞接近融合状态时进行传代,程序降温法冻存,速溶方法复苏,确定解冻后细胞复苏率、克隆生长与分化情况,并对其生物学特性进行鉴定。分三阶段诱导hESCs定向生成神经干细胞（NSCs）。形态学观察结合免疫荧光细胞化学和RT-PCR检测神经干细胞标志;NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。模拟体内多巴胺神经元分化发育的不同阶段及微环境,采用早期添加音猥因子（SHH）及成纤维细胞生长因子-8（FGF8）的方法,诱导hESCs定向生成多巴胺能神经元（A组）,并与传统的诱导方法（B组）相比较,免疫荧光细胞化学和RT-PCR法检测多巴胺能神经元的标志,高效液相色谱法检测诱导后细胞及细胞培养上清液中多巴胺（DA）及其代谢产物高香草酸（HVA）的含量。建立帕金森病（PD）大鼠模型,随机分为治疗组和对照组。利用立体定位技术将分化后的细胞移植到PD大鼠的纹状体内,对照组植入生理盐水。免疫组化法证实移植细胞的存活并以诱发旋转行为的改善来观察其治疗作用。【结果】hESCs稳定增殖了5个月,传代20代;细胞在MEF上呈集落生长,细胞核大,核仁明显。程序降温法冻存后复苏,细胞复苏率达到78.3%;解冻后第12代细胞仍具有稳定的46XX核型;表达hESCs特异性蛋白及基因。经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因;所诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。诱导的细胞表达多巴胺能神经元的特异性基因及蛋白。A组TH的阳性表达率（73.68±4.71%）明显高于B组（31.37±1.63%）;RT-PCR检测结果显示A组TH、Nurr1、Lmx1B表达量均高于B组;高效液相色谱方法检测A组终止诱导后细胞内及细胞外DA、HVA含量均高于B组（P＜0.01,P＜0.05）。移植前1-4周、移植后1-8周大鼠旋转行为检测结果:治疗组由移植前289±60圈/30分钟下降至229±37（P＜0.05）;而对照组移植前（290±47）、移植后（286±34）,临床表现无改善（P＞0.05）。TH免疫组化染色显示移植后治疗组大鼠纹状体内存在着TH阳性细胞,散在分布;而对照组纹状体内未见TH阳性细胞。【结论】成功建立了hESCs体外培养模式,为研究hESCs及相关疾病的防治提供细胞模型和细胞来源;三步诱导法可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力;SHH及FGF8早期联合作用可高效的促进hESCs分化为多巴胺能神经元,且这些神经元有分泌多巴胺的功能;诱导分化出的多巴胺能神经元移植后,PD模型大鼠行为学明显改善,对PD有一定的治疗作用,为临床治疗PD提供了基础。

论文目录

• 一、缩略词表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、前言
• 五、第一部分
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 六、第二部分
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 七、第三部分
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 八、第四部分
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 九、小结
• 十、结论
• 十一、参考文献
• 十二、文献综述
• 十三、攻读学位期间发表文章及参加学术会议情况
• 十四、个人简历
• 十五、致谢