日本刺沙蚕蛋白酶的纯化、鉴定及日本刺沙蚕纤溶酶的部分药效学研究

论文摘要

血栓性疾病（thrombotic disease, TD）包括血栓形成（thrombosis）和血栓栓塞（thromboembolism）。血栓性疾病已经成为严重危害人类生命健康的“头号杀手”,不仅发病率高居各种疾病之首,而且致残率、致死率和复发率也很高。目前,临床上常用的抗栓治疗方法主要是溶栓治疗。过去十年中,国内外临床常用的溶栓剂有尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤溶酶原激活剂、蛇毒降纤酶类（东菱迪芙）及蚓激酶等。但是所有这些溶栓剂都有不可避免的副作用,包括需要加大剂量治疗、有限的纤维蛋白特异性、再阻塞和出血倾向等。所以,从各种天然生物资源中寻找和研发溶解纤维蛋白特异性高、出血副作用小及相对较便宜的溶栓剂一直是研究的热点。日本刺沙蚕是一种海洋无脊椎动物,广泛分布于我国的渤海、黄海沿岸及长江口等地区,此外还有日本太平洋沿岸。目前日本刺沙蚕主要被用作鱼虾的优质饵料,同时也是海洋垂钓的优质钓饵。本实验室前期已经从日本刺沙蚕体内发现了一种新的名为日本刺沙蚕纤溶酶（NJF）的丝氨酸蛋白酶,该实验过程中还发现有另外一种特殊纤溶活性及性质的蛋白酶—日本刺沙蚕蛋白酶（NJP）,有可能开发成新的溶栓剂,更好的实现其经济和社会价值。本论文主要包括两个部分的研究,第一部分包括前三章,是关于日本刺沙蚕蛋白酶（NJP）的分离纯化工艺的建立,分子特征及酶学性质的检测；第二部分包括第四章,是关于NJF的体内部分药效学实验。现将主要研究结果分述如下：1.通过酶的粗提、硫酸铵分级盐析、苯柱疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,最终得到单一成分的、纯度较高的酶制剂,命名为日本刺沙蚕蛋白酶（N.japonica protease, NJP）,最终纯化了1556倍,回收率为13%；以S-2238为特异性底物时,生色底物法测得NJP的特异性酶活力为10113.9 U/mg。2.通过MALDI-TOF MS和SDS-PAGE电泳检测NJP是一个相对分子量为28.6～33.5kDa的单链蛋白质；2-DE检测其等电点为9.2。3.通过串联质谱MALDI-TOF/TOF MS测序并进行De Novo分析,获得3段共28个氨基酸序列,分别是：V-T-V-V-Q-Y-R; S-T-N-A-S-S-G-Y-L-N-L-R和V-Y-L-L-D-T-G-L-R.将此序列在NCBI的non-redundant protein sequences （nr）和Swiss-Prot数据库利用protein-protein BLAST （blastp）软件进行比对,发现NJP是一种新发现的蛋白酶；将此序列登陆UniProt knowledgebase数据库中,获得登录号P86834, EC 3.4.21.-。4. Azocasein水解法测定NJP的最适温度为40℃,且在30℃-60℃比较稳定；其最适pH为9.0,且在pH7.0-pH11.0时能保持最大活性的80%以上,表明NJP是-种碱性蛋白酶。5. Azocasein水解法测定的结果表明Hg2+几乎能完全抑制NJP的酶活性,Co2+和Mg2+也能部分抑制其酶活性,其它金属离子对酶活性的抑制和活化作用都不明显。6. Azocasein水解法测定的结果表明NJP的酶活性可以完全被典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制,其他蛋白酶抑制剂的抑制作用均不明显,表明NJP属于典型的丝氨酸蛋白酶类。7.纤维蛋白平板法表明,NJP可以直接降解纤维蛋白,基本上无激酶作用,不是纤溶酶原激活剂；NJP具有很强的纤溶活性,以UK标准品为对照,NJP的纤溶活力为12000U/mg；8.采用SDS-PAGE电泳法分析NJP水解纤维蛋白原的活性,结果表明NJP水解纤维蛋白原的先后顺序是：Aα链>Bp链>γ链。9.生色底物法表明,NJP对凝血酶特异性底物S-2238特异性较高,其特异性水解活性为10.11±2.7 mmol/min/mg;以上结果表明NJP是一种新的碱性凝血酶样丝氨酸蛋白酶。10.采用纤维蛋白平板法,以UK为对照,本实验所用的NJF酶制剂的纤溶活力为30000U/mg,我们将NJF的纤溶活性定为10BU/mg。。11.本实验采用管腔内线栓法成功建立了大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。12.通过神经功能损害评分和TTC染色,结果表明静脉输注NJF可以显著降低神经功能损害评分并剂量依赖性的降低缺血再灌注引起的脑梗死。13.静脉输注NJF可以剂量依赖性的降低缺血再灌注引起的脑水肿。14.静脉输注NJF可以显著降低MDA水平,提高SOD的活性,对抗脂质过氧化,提高内源性的抗氧化功能。15.静脉输注5BU/kg的NJF和临床等效剂量的15000U/kg的UK在减少脑梗死和降低脑水肿,以及对抗脂质过氧化和增强抗氧化活性等方面有几乎相等的功效；NJF对缺血再灌注大鼠大脑引起的局灶性脑缺血有潜在的神经保护功能；NJF具有神经保护功能的机制可能是：抑制脂质过氧化和增强内源性的抗氧化酶类。综上所述,本论文从日本刺沙蚕体内分离纯化并鉴定出一种明显不同于NJF和其他纤溶酶的新蛋白酶（NJP）。NJP是一种具有很高纤溶活性的碱性凝血酶样丝氨酸蛋白酶,可以直接降解纤维蛋白而不同于纤溶酶原激活剂。以上结果表明NJP具有成为防治血栓的新的溶栓剂的潜能；同时,本论文首次证明NJF对大鼠大脑中动脉阻断再灌注引起的局灶性脑缺血有很强的神经保护作用,此结果为NJF的进一步药效学和临床实验研究奠定了坚实的基础。

论文目录

• 内容提要
• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1 血栓性疾病
• 2 凝血与抗凝的基本原理
• 2.1 凝血系统
• 2.2 抗凝系统
• 2.3 纤溶系统
• 3 溶栓剂的研究进展
• 3.1 第一代溶栓剂
• 3.2 第二代溶栓剂
• 3.3 第三代溶栓剂
• 3.4 新来源的溶栓剂
• 4 血栓动物模型研究进展
• 4.1 不需要开颅的模型
• 4.2 需要开颅的模型
• 4.3 结束语
• 5 沙蚕的研究进展
• 5.1 双齿围沙蚕的研究
• 5.2 日本刺沙蚕的研究
• 6 立题依据及研究目标
• 6.1 立题依据
• 6.2 研究目的
• 6.3 研究意义
• 第2章 日本刺沙蚕蛋白酶的分离与纯化
• 1 实验材料
• 1.1 主要材料
• 1.2 仪器设备
• 1.3 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 日本刺沙蚕蛋白酶的分离纯化
• 3 实验结果
• 3.1 日本刺沙蚕蛋白酶的分离纯化
• 3.2 日本刺沙蚕蛋白酶的纯度鉴定
• 4 讨论
• 4.1 NJP纯化工艺的建立
• 4.2 蛋白酶的活性测定
• 5 小结
• 第3章 日本刺沙蚕蛋白酶的分子特征与酶学性质研究
• 1 实验材料
• 1.1 日本刺沙蚕蛋白酶
• 1.2 仪器设备
• 1.3 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 分子量的测定
• 2.2 等电点的测定
• 2.3 氨基酸序列分析
• 2.4 温度对酶活性的影响
• 2.5 pH对酶活性的影响
• 2.6 金属离子对酶活性的影响
• 2.7 蛋白酶抑制剂对酶活性的影响
• 2.8 激酶活性及纤溶活力的检测
• 2.9 纤维蛋白原水解活性分析
• 2.10 特异性底物的确定
• 3 实验结果
• 3.1 NJP的分子量
• 3.2 NJP的等电点
• 3.3 NJP的部分氨基酸序列分析
• 3.4 温度对酶活性的影响
• 3.5 pH对酶活性的影响
• 3.6 金属离子对酶活性的影响
• 3.7 蛋白酶抑制剂对酶活性的影响
• 3.8 激酶活性及纤溶活性的检测
• 3.9 纤维蛋白原水解活性分析
• 3.10 特异性底物的确定
• 4 讨论
• 4.1 NJP的分子特征
• 4.2 NJP的酶学特征
• 5 小结
• 第4章 日本刺沙蚕纤溶酶对缺血再灌注大鼠的脑保护作用
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 仪器设备
• 1.3 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 NJF纤溶活性的测定
• 2.2 管腔内线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型
• 2.3 分组及给药
• 2.4 神经功能损害评分
• 2.5 脑梗死范围测量
• 2.6 脑含水量测量
• 2.7 MDA水平及SOD活性的测定
• 2.8 统计学分析
• 3 实验结果
• 3.1 NJF纤溶活性的测定
• 3.2 神经功能损害评分
• 3.3 脑梗死范围测定
• 3.4 脑含水量的测定
• 3.5 NJF对MDA水平和SOD活性的影响
• 4 讨论
• 4.1 NJF对缺血再灌注大鼠的脑保护作用
• 4.2 NJF对缺血再灌注大鼠大脑内MDA水平和SOD活性的影响
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 作者简介及攻读博士期间取得的主要学术成果
• 致谢