黑茶藨子（Ribes nigrum L.）含Cytb5结构域脱氢酶基因的克隆与功能研究

论文题目: 黑茶藨子（Ribes nigrum L.）含Cytb5结构域脱氢酶基因的克隆与功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 陆万香

导师: 李名扬,胡赞民

关键词: 黑茶藨子,含结构域的脱氢酶,基因克隆,脂肪酸脱氢酶基因,鞘脂脱氢酶基因,酿酒酵母,功能鉴定,进化关系

文献来源: 西南农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 含Cytb5结构域的脱氢酶是近些年发现的一类新的小家族蛋白,这些蛋白都含有一个标志Cytb5蛋白特征的血色素结合区:“His-Pro-Gly-Gly domain”;同时,它们还含有膜结合脱氢酶所必需的三个保守的“His Box”,通常为HisⅠ区HK3-4H、HisⅡ区HX2-3HH和HisⅢ区（H/Q）X2/3HH。现已知:Δ6-、Δ5-和Δ4-脂肪酸脱氢酶、脂肪酸羟基化酶以及Δ8-鞘脂脱氢酶是该家族蛋白的主要成员。在植物中,此类蛋白研究最多的是△6-脂肪酸脱氢酶和Δ8-鞘脂脱氢酶,前者是γ-亚麻酸生产中的关键酶,后者可能涉及植物的细胞程序性死亡和抗逆作用,因此具有重要研究意义。本研究以富含γ-亚麻酸的植物黑茶藨子（Ribes nigrum L.）为材料,利用基因组步移方法从黑茶藨子DNA中克隆获得了多个含Cytb5结构域的脱氢酶基因,通过酿酒酵母异源表达初步鉴定了基因功能,并进行了基因间功能差异和进化关系等方面的分析研究。主要研究结果如下: 1 含Cytb5结构域脱氢酶基因的克隆 根据已知的Δ6-脂肪酸脱氢酶和Δ8-鞘脂脱氢酶保守区序列设计简并引物,以黑茶藨子DNA为模板,通过PCR扩增技术,共获得三个约1032bp大小的脱氢酶相关基因的中间片断。在此基础上,利用基因组步移技术,获得两个含Cytb5结构域的脱氢酶相关基因的全长序列RnCyDA、RnCyDB,以及一个含有ATG起始密码子的含Cytb5结构域的脱氢酶相关基因片断RnCyDC。 RnCyDA、RnCyDB全长1347bp,编码448个氨基酸,RnCyDB第54位含一个终止子;RnCyDC片断长1140bp。RnCyDA、RnCyDB和RnCyDC具有共同特点:在第41aa位点处具有Cytb5蛋白标志的HPGG domain,在159～163aa、196～200aa、375～

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

第1章 文献综述

1.1 多不饱和脂肪酸研究进展

1.1.1 多不饱和脂肪酸的生物合成途径

1.1.2 多不饱和脂肪酸的生物功能

1.1.3 多不饱和脂肪酸的资源

1.1.4 PUFA的生产策略

1.2 植物鞘脂研究进展

1.2.1 植物鞘脂的结构

1.2.2 鞘脂的合成与代谢

1.2.3 鞘脂在植物中的功能

1.2.4 结语

1.3 含细胞色素B_5结构域蛋白研究

1.3.1 含Cytb_5结构域蛋白的种类

1.3.2 含Cytb_5结构域蛋白研究进展

1.2.3 含Cytb_5结构域蛋白的进化关系分析

第2章 引言

第3章 实验材料和方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 黑茶藨子基因组DNA的提取

3.2.2 同源基因片断的克隆

3.2.3 参照Universal Genome Walker~(TM) Kit步骤方法进行基因组步移

3.2.4 RnCyDB的定点突变构建

3.2.5 嵌合基因RnCyDCA、RnCyDCB的构建

3.2.6 DNA的琼脂糖凝胶电泳

3.2.7 目的片段的回收

3.2.8 回收产物的加A反应

3.2.9 目的片段与pMD18-T载体的连接

3.2.10 大肠杆菌转化

3.2.11 目的片段检测及测序

3.2.12 甘油管的制备

3.2.13 目的片段的序列分析

3.2.14 酵母表达载体的构建：

3.2.15 酿酒酵母表达体系与检测方法

3.2.16 采用LiAC转化方法进行酵母转化

3.2.17 RnCyDA在酿酒酵母中的诱导表达实验

3.2.18 LCB提取、氧化和甲脂化

3.2.19 植物鞘胺醇标准峰图的制备

3.2.20 RnCyDCA、RnCyDCB在酿酒酵母中的诱导表达实验

3.2.21 酵母菌脂肪酸的提取和甲脂化

3.2.22 LA、GLA和ALA标准峰图的制备

3.2.23 甲酯化的终产物GC-MS检测分析实验

第4章 结果与分析

4.1 通过同源序列克隆获得RNCYDA／B／C基因

4.2 基因组步移获得全长基因RNCYDA、RNCYDB和基因片断RNCYDC

4.3 RNCYDA、RNCYDB和RNCYDC推测编码氨基酸序列同源性分析

4.4 RNCYDA和RNCYDB的DNA序列、推测编码氨基酸序列及其特征分析

4.4.1 RnCyDA的DNA全长序列及其编码氨基酸序列

4.4.2 RnCyDA推测编码氨基酸特征分析

4.4.3 RnCyDB的DNA全长序列及其推测编码氨基酸序列

4.4.4 RnCyDB的定点突变

4.4.5 RnCyDB1推测编码氨基酸序列特征分析

4.5 嵌合基因RNCYDCA、RNCYDCB的构建

4.6 嵌合基因RNCYDCA、RNCYDCB推测编码氨基酸序列

4.6.1 嵌合基因RnCyDCA和RnCyDCB全长DNA序列及其编码氨基酸序列

4.6.2 RnCyDCA、RnCyDCB推测的编码氨基酸序列特征分析

4.7 RNCYDA，RNCYDB1，RNCYDCA／CB的酿酒酵母表达载体构建

4.8 RNCYDA基因具有Δ8-鞘脂脱氢酶功能

4.8.1 酵母中LCB的检测方法的建立

4.8.2 RnCyDA基因具有Δ8-鞘脂脱氢酶功能

4.9 嵌合基因RNCYDCA、RNCYDCB具有Δ6-脂肪酸脱氢酶功能

4.9.1 以LA(ω-6)为底物的催化功能

4.9.2 以ALA(ω-3)为底物的催化功能

第5章 讨论

5.1 含CYTB_5结构域脱氢酶的结构域特征与功能关系

5.2 RNCYDA的Δ8-鞘脂脱氢酶功能

5.3 构建嵌合基因RNCYDCA和RNCYDCB的理论依据

5.4 嵌合基因编码蛋白RNCYDCA和RNCYDCB的功能差异分析

5.5 RNCYDB1与RNCYDCB功能与结构分析

5.6 含CYTB_5结构域蛋白的进化关系研究

第6章 结论

参考文献

缩略语

附录

致谢

发布时间: 2005-07-19

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