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嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达

2020-11-23阅读(307)

嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达

论文摘要

糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,系统命名为淀粉α-1.4-葡聚糖葡萄糖水解酶,α-1.4-Glucanglucohydrolase（EC.3.2.1.3）],是一种具有外切活性的酶,它能把淀粉、糊精、糖原等从非还原性末端水解α-1.4-葡萄糖苷键,而得到终产物?-D-葡萄糖,也能缓慢水解α-1.6-葡萄糖苷键,转化为葡萄糖,是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之一。糖化酶具有重要商业价值,凡对淀粉、糊精、低聚糖进行酶水解的工业上,都可适用。尽管糖化酶对α-1.6-糖苷键的活性只有α-1.4-糖苷键的0.2%,这足以在工业糖化过程中影响产量。这一特性及在其他方面的需求产生现在研究人员对糖化酶的目标特定的蛋白质工程研究。目前国内外已筛选出多种糖化酶生产菌,并将其分离提纯。但市场应用的糖化酶主要来源于常温菌,因产品成本高,热稳定性差,储存期短,酶活力和产率低而制约糖化酶在农业、工业上的应用。由此可见,热稳定性糖化酶的研究和开发具有重要的商业价值。嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,但未见该菌嗜热糖化酶的报道。本研究中C. thermophilum在以可溶性淀粉为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了糖化酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的糖化酶。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为64kDa。该酶的最适反应温度和pH分别为65℃和4.0。在pH4.5条件下,该酶在50℃以下稳定,70℃的半衰期为20min。Ca2+,Mg2+,Na+,K+对酶有激活作用,一些重金属离子Fe2+,Ag+,Hg2+对酶有显著的抑制作用。该糖化酶是一种糖蛋白,含糖量为11.7%。C. thermophilum热稳定糖化酶的N-端15个氨基酸序列为Ala-Val-Asp-Ser-Tyr-Ile- Glu-Arg-Glu-Thr-Pro-Ile-Ala-Trp-Asn,与Neurospora crassa,Humicola grisea和Thielavia terrestris糖化酶的N-端氨基酸序列有较高的同源性。根据C. thermophilum热稳定糖化酶的N-端氨基酸序列和同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端（RACE）的方法,克隆了该糖化酶的编码基

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩略词及中文对照表
  • 第一章 文献综述
  • 引言
  • 1. 糖化酶的产生
  • 2. 糖化酶的分子结构
  • 3. 糖化酶的作用方式
  • 4. 糖化酶对淀粉的作用机制
  • 5. 糖化酶活性测定方法与分析
  • 6. 糖化酶的分离纯化
  • 7. 糖化酶的基因克隆及表达的研究
  • 8. 蛋白质工程提高糖化酶活性
  • 9. 糖化酶的应用
  • 10. 糖化酶的生产研究发展方向
  • 选题的目的意义
  • 第二章 嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）热稳定性糖化酶的纯化及特性
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 不同培养时间对糖化酶活性的影响
  • 2.2 酶的分离纯化
  • 2.3 薄层层析
  • 2.4 高效液相色谱（HPLC）
  • 2.5 总糖含量
  • 2.6 糖化酶的特性研究
  • 2.7 N-端氨基酸序列测定
  • 3. 讨论
  • 3.1 Chaetomium thermophilum 糖化酶的纯化方法
  • 3.2 Chaetomium thermophilum 糖化酶的稳定性
  • 3.3 Chaetomium thermophilum 糖化酶活性与金属离子的关系
  • 3.4 Chaetomium thermophilum 糖化酶的作用方式
  • 3.5 Chaetomium thermophilum 糖化酶的应用潜力和存在的问题
  • 第三章 嗜热毛壳菌热稳定性糖化酶基因的cDNA 克隆及其序列分析
  • 1. 材料和方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 实验方法
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 引物设计
  • 2.2 Chaetomium thermophilum 总RNA 的提取
  • 2.3 糖化酶基因的分离
  • 2.4 糖化酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
  • 3. 讨论
  • 3.1 用RACE 技术分离基因
  • 3.2 糖化酶基因gla 结构
  • 第四章 Chaetomium thermophilum 热稳定糖化酶基因在毕赤酵母中的表达
  • 1. 材料和方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 试验方法
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 糖化酶成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析结果
  • 2.2 糖化酶基因的定点突变
  • 2.3 糖化酶基因在毕赤酵母中的表达
  • 3. 讨论
  • 3.1 Pichia pastoris 表达系统表达重组糖化酶
  • 3.2 表达糖化酶的酶学特性
  • 第五章 结论和建议
  • 1. 结论
  • 2. 建议
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表论文情况

    • 相关论文文献

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