蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究

论文摘要

精氨酸激酶（AK,EC 2.7.3.3）是磷酸原激酶的一种,广泛地存在于无脊椎动物中,是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。由于AK仅存在于无脊椎动物中,与脊椎动物中参与能量代谢的肌酸激酶不同,因此AK可以作为控制昆虫的一个很好的靶标。本研究以蝗虫精氨酸激酶为研究对象,利用化学修饰法研究AK活性中心的必需基团,并以黄酮类物质筛选有效的AK抑制剂。本试验的主要结果如下:1.精氨酸激酶活性中心半胱氨酸的研究:使用DTNB对精氨酸激酶半胱氨酸进行化学修饰,结果发现随修饰剂浓度增加,精氨酸激酶的活性逐渐丧失,这表明半胱氨酸位于该酶的活性中心部位。采用邹氏作图法求得该酶活性中心必需半胱氨酸残基的数目为1。利用DTT还原被DTNB修饰的精氨酸激酶推测这个必需半胱氨酸残基的位置及作用,结果显示这个半胱氨酸有可能位于ATP的结合位点附近。2.精氨酸激酶活性中心精氨酸的研究:通过测定酶活性解离基团的性质,发现蝗虫精氨酸激酶活性中心标准解离热焓为12.38 kcal/mol,表明该酶的活性中心的可解离基团是精氨酸的侧链胍基。又以苯乙二醛为专一的修饰剂作用于蝗虫精氨酸激酶的精氨酸残基,根据Ray等的方法求得每个酶分子中仅有一个精氨酸是酶活性所必需的。通过考察底物对苯乙二醛修饰的保护作用,结果发现ATP对苯乙二醛修饰该酶存在保护作用,这表明该精氨酸可能位于ATP的结合位点附近。3.精氨酸激酶抑制剂效果的研究:黄酮类物质对体内和体外的精氨酸激酶都有一定的抑制效果。对5龄蝗虫喷洒槲皮素和木犀草素六天后,提取精氨酸激酶测活发现酶活力仅为原来的36.9%和76.5%;在体外实验中当槲皮素和木犀草素的浓度达到40μmol/L时,酶活性分别下降了89.3%和63.9%。并进一步通过双倒数作图确定了槲皮素和木犀草素对精氨酸激酶的抑制类型和抑制常数。4.精氨酸激酶抑制剂机理的研究:利用猝灭对抑制机理进行研究,确定槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶发生静态猝灭,说明槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶能相互结合并结合在色氨酸周围。利用Stem-Volmer法求得其结合常数和结合位点。根据Forster非辐射能量转移机理,分别求算了槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶之间的距离,并根据热力学参数推测了槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶相互作用力是静电作用力。根据猝灭结果和抑制效果,推测槲皮素和木犀草素对精氨酸激酶的抑制活性的不同很有可能是由于结构上的差异引起的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 精氨酸激酶的研究背景
• 1.2 蛋白质的化学修饰
• 1.2.1 蛋白质化学修饰概述
• 1.2.2 蛋白质侧链基团各氨基酸残基的修饰反应
• 1.2.3 精氨酸激酶的催化机制和活性中心
• 1.3 精氨酸激酶抑制剂的研究进展
• 1.3.1 精氨酸激酶抑制剂
• 1.3.2 荧光猝灭对小分子物质和蛋白质结合机理的研究
• 1.3.3 生物农药的研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂和仪器设备
• 2.3 精氨酸激酶的分离纯化
• 2.3.1 试剂的配制
• 2.3.2 精氨酸激酶的纯化方法
• 2.4 精氨酸激酶活性中心化学修饰测定
• 2.4.1 精氨酸激酶浓度和活力的测定
• 2.4.2 精氨酸激酶活性中心半胱氨酸的测定
• 2.4.3 精氨酸激酶活性中心精氨酸的测定
• 2.5 精氨酸激酶抑制剂的研究
• 2.5.1 精氨酸激酶活性的测定
• 2.5.2 槲皮素和木犀草素对体内精氨酸激酶的抑制效应测定
• 2.5.3 槲皮素和木犀草素对体外精氨酸激酶的抑制效应的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 精氨酸激酶活性中心必需基团的研究
• 3.1.1 精氨酸激酶活性中心半胱氨酸的研究
• 3.1.1.1 精氨酸激酶必需巯基数目的确定
• 3.1.1.2 DTT 还原AK-TNB 对其活力及光谱的影响
• 3.1.1.3 AK-TNB 在DTT 存在的底物复活反应动力学
• 3.1.1.4 底物ATP 对AK-TNB 复活的影响
• 3.1.2 精氨酸激酶活性中心精氨酸的研究
• 3.1.2.1 pH 对精氨酸激酶催化ATP 反应的效应
• 3.1.2.2 精氨酸激酶活性中心功能基团的解离热焓
• 3.1.2.3 PG 对精氨酸激酶中精氨酸残基的化学修饰
• 3.1.2.4 精氨酸激酶活性中心必需精氨酸数目的测定
• 3.1.2.5 底物对精氨酸化学修饰的保护作用
• 3.2 精氨酸激酶抑制剂的研究
• 3.2.1 槲皮素和木犀草素对体内外精氨酸激酶活性的抑制作用
• 3.2.2 槲皮素和木犀草素对精氨酸激酶抑制类型的研究
• 3.2.3 槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶的荧光光谱研究
• 3.2.4 槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶猝灭的作用机理
• 3.2.5 槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶结合常数和结合位点的研究
• 3.2.6 槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶的作用力类型研究
• 3.2.7 槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶中色氨酸作用距离的研究
• 4 讨论
• 4.1 精氨酸激酶活性中心必需基团的研究
• 4.2 精氨酸激酶抑制剂的研究
• 4.3 进一步研究方向
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文