大型褐藻配子体培养及海带自交系AFLP分析

论文摘要

海带、裙带菜等大型褐藻配子体既是商业化海藻养殖、育种和育苗技术的重要材料来源,也是目前进行海藻遗传学等研究的切入点,因此如何获得能够满足不同实验需求的配子体成为人们研究的焦点。本文从成熟裙带菜孢子叶采集游孢子开始到配子体发育形成幼孢子体为止进行了跟踪观察研究,对比了光照强度、温度、光周期等不同环境因子对配子体营养生长的调控作用。实验发现,光强和温度等外界环境因素对配子体生长和发育有很大影响,光照越强、光照时间越长、温度越高,配子体的生长越快,但各种单一因素的影响又表现出一定的差异性。22±1℃、1500lx光强、14:10h（L:D）光周期是实验室中配子体培养的最佳条件;在温度为18±1℃、光周期14:10h（L:D）、光照强度2000lx条件下10天内配子体能够完全发育形成幼孢子体。在裙带菜配子体种质保存和培养过程中,硅藻等杂藻的污染是十分棘手的问题。这些杂藻阻碍藻体生长,严重时还会造成藻种的死亡。硅藻是最常见、最难处理的杂藻污染之一,需要外借药物来抑制其生长。硅藻的生长温度范围广,适应能力特别强,繁殖十分迅速。在配子体培养中硅藻与配子体争夺营养、光照等生长条件,限制其正常的生长发育,导致配子体得不到足够的光照和营养而变绿死亡。本研究筛选了裙带菜配子体对二氧化锗毒性的耐受浓度范围,并对硅藻的生长变化进行了比较。结果表明,在本试验中应当选择1～5mg/L二氧化锗作为裙带菜配子体种质保存和培养过程中的硅藻抑制剂,最佳浓度为1mg/L,此时的配子体能够正常营养生长,硅藻污染降到最低,与其他已经报道的几种海藻培养所用二氧化锗浓度相似。以上述配子体培养和杂交育种技术为基础,培育了我国主要养殖海带品种的自交系和混交系。在海带遗传育种研究中,仅根据其形态特征对海带种质进行鉴定是不够的,有必要通过生化及DNA分子标记等技术进行种质鉴定和遗传关系分析。实验利用AFLP分子标记技术,以野生品种自交系和栽培品种混交系为对照,研究了我国几个主要养殖海带品种自交系间的遗传多样性和亲缘关系,揭示了自交系内部的遗传差异,分析了亲代个体的纯合情况。结果表明,十个品系间海带自交系内部高度一致,亲本纯合度很高。10对引物共扩增出清晰可辨的条带434条,其中多态性带141条,多态性比率分布在20～40%之间,平均每对引物组合生成43.4条扩增带,14.1条多态性带,平均多态性检出比例为32.5%。结合AFLP图谱分析可见,烟杂、烟台901和青岛野生海带品系的多态性最高,我国主要养殖海带品种可能起源于同一类群,有些品系没有达到育种的要求,育种方式还有待改进。该研究为今后我国海带新品系培育、旧种质改良提供了新的思路。通过AFLP操作获得的差异显示条带代表着不同海带品种之间的差别,这些变化主要是海带养殖过程中生长环境不同而产生的一些可遗传的变异。欲了解和研究该功能特异性基因,首先要获得其全长序列,而RNA的提取和纯化是褐藻基因克隆的必由之路。以裙带菜配子体为材料对比分析了四种方法,改进SDS法、CTAB法、Trizol试剂盒、RNAiso Reagent试剂盒法提取RNA的质量和纯度,并采用RT-PCR对mRNA反转录,对mRNA的可用性进行了检测。结果表明,两种试剂盒Trizol和RNAiso Reagent及其改进的方法无法得到完整的裙带菜配子体总RNA;CTAB法提取的总RNA条带清晰完整但有明显的基因组DNA残留并有多糖和蛋白质污染;改进SDS法提取的总RNA三条带清晰,OD值介于1.8～2.0之间,可应用于后续的RT-PCR实验,是一种较为理想的裙带菜等褐藻类配子体RNA提取的方法。该方法用于其它大型海藻的总RNA提取,效果也比较好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 大型海洋褐藻生物技术研究进展与成就
• 1.1 大型海洋褐藻细胞工程与应用研究
• 1.1.1 育种、育苗技术
• 1.1.2 单克隆配子体培养技术
• 1.1.3 组织培养技术
• 1.1.4 种质保存技术
• 1.2 大型海洋褐藻分子生物学研究进展
• 1.2.1 基因工程
• 1.2.2 海藻核酸提取
• 1.2.3 大型褐藻DNA 分子遗传标记研究
• 1.3 海藻活性物质开发与应用
• 第二章 大型褐藻配子体培养（裙带菜为例）
• 第一节 不同培养方式对裙带菜配子体生长发育的影响
• 2.1.1 主要仪器与试剂
• 2.1.2 材料与方法
• 2.1.2.1 实验条件的设定
• 2.1.2.2 孢子叶处理与游孢子采集
• 2.1.2.3 配子体生长过程中的形态对比
• 2.1.2.4 雌雄配子体的分离和扩大培养
• 2.1.2.5 不同培养条件对配子体营养生长的影响
• 2.1.2.6 配子体发育及幼孢子体形成主要阶段的观察
• 2.1.3 结果分析与讨论
• 2.1.3.1 配子的形成与生长
• 2.1.3.2 光强、光周期、温度等因素对配子体生长的影响
• 2.1.3.3 雌雄配子体发育及幼孢子体形成主要阶段的显微观察
• 第二节 二氧化锗对裙带菜配子体培养中硅藻污染的防治作用
• 2.2.1 实验仪器与药品
• 2.2.2 材料与方法
• 2.2.2.1 实验材料
• 2.2.2.2 实验方法
• 2.2.2.2.1 预实验（对裙带菜配子体可承受二氧化锗浓度的初测）
• 2.2.2.2.2 二氧化锗对裙带菜配子体生长的影响
• 2.2.2.2.3 硅藻污染的配子体中二氧化锗的作用
• 2.2.2.2.4 不同浓度二氧化锗对硅藻生长的影响
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 二氧化锗对裙带菜配子体生长的影响
• 2.2.3.2 叶绿素和可溶性蛋白含量的变化
• 2.2.3.3 不同浓度二氧化锗对硅藻生长的影响
• 2.2.3.4 二氧化锗对硅藻污染的配子体的作用
• 2.2.4 讨论与结语
• 第三章 我国主要养殖海带品种自交系遗传多样性和亲缘关系的AFLP分析
• 3.1 主要仪器设备
• 3.2 主要生化试剂及溶液的配制
• 3.2.1 生化试剂
• 3.2.2 AFLP 分析所用溶液的配制
• 3.3 材料与方法
• 3.3.1 材料准备
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.2.1 基因组DNA 提取
• 3.3.2.2 基因组DNA 的酶切和连接
• 3.3.2.3 预扩增
• 3.3.2.4 选择性扩增
• 3.3.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.3.2.5.1 胶的制备
• 3.3.2.5.2 电泳
• 3.3.2.5.3 银染检测
• 3.3.3 结果统计与分析方法
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 海带幼孢子体DNA 提取方法优化
• 3.4.2 酶切连接、预扩增
• 3.4.3 选择性扩增与带型图谱
• 3.4.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱结果
• 3.4.3.2 影响聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱效果的因素
• 3.4.4 十个海带品系类群的聚类分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 AFLP 在分子标记技术中的优越性
• 3.5.2 关于我国海带养殖品系遗传多样性与亲缘关系的几点思考
• 第四章 大型褐藻配子体 RNA 提取方法的比较研究
• 4.1 实验仪器与药品
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验器具的处理
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.3.1 RNA 的提取步骤
• 4.2.3.1.1 改进SDS 法提取过程
• 4.2.3.1.2 CTAB 法提取流程
• 4.2.3.1.3 Trizol 试剂盒法提取步骤
• 4.2.3.1.4 RNA 提取试剂盒（RNAiso Reagent）提取步骤
• 4.2.3.1.5 RNeasy Plant Mini Kit 操作过程
• 4.2.3.2 RNA 样品中DNA 的去除
• 4.2.3.3 RNA 纯度的检测
• 4.2.3.4 RT-PCR 检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 RNA 电泳检测
• 4.3.2 RT-PCR 检测
• 4.4 讨论
• 第五章 小结
• 参考文献
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢