座囊霉细胞催化桦木醇区域选择性氧化合成桦木酮醇的研究

论文摘要

自上世纪80年代，癌症和艾滋病成为威胁人类健康的两大疾病。从天然产物中寻找新的治疗药物已成为药物化学领域的研究热点。桦木醇及其衍生物显示出与以往药物不同的作用机制，在癌症和艾滋病的治疗中表现出巨大的应用潜力。相对桦木酮醇，桦木醇在自然界中含量高，以其为先导化合物，开发高活性的衍生物将产生良好的社会效益和经济效益。研究表明桦木酮醇生物活性远高于桦木醇。与化学法相比，微生物转化具有反应条件温和、绿色环保和选择性高等优点。故本研究首先以桦木醇为先导化合物，在众多微生物中筛选能催化该化合物转化的菌株，并系统地研究了不同反应条件对其催化特性的影响规律；在此基础上，通过紫外诱变获得正突变株，系统优化不同反应条件。在所研究的52株菌中，海洋真菌座囊霉Dothideomycete sp. HQ316564是唯一一株能催化桦木醇区域选择性氧化合成桦木酮醇的菌株。其催化桦木酮醇合成的最适培养基初始pH、反应温度、添加剂DMSO的浓度及反应时间分别为6.0、33℃、0.4%（v/v）和6天。在最适条件下，桦木酮醇的总产率达43.4%。为了进一步提高座囊霉细胞催化桦木酮醇合成的反应效率，对原始菌株Dothideomycete sp. HQ316564进行了紫外诱变育种，分离得到一株正突变菌株-Dothideomycete sp. UV14，在上述最适条件下反应1天，桦木酮醇的总产率达23.2%，远高于原始菌株在相同条件下的总产率（13.4%）。该突变株催化桦木酮醇合成反应的最适培养基初始pH、反应初始pH、预培养时间、反应时间、预培养温度和反应温度分别为5.5、7.0、36h、48h、28℃和33℃。在最适条件下，桦木酮醇的总产率达71.7%。相对原始菌株，该突变株的催化效率及桦木酮醇的总产率均得到了显著提高。本研究筛选到一株能催化桦木醇区域选择性氧化合成桦木酮醇的海洋微生物，开辟了一条高效转化桦木醇合成桦木酮醇的生物催化新途径。资源丰富的海洋微生物的应用可望为生物催化领域的发展提供新的动力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 五环三萜的生物活性与药用价值
• 1.2.1 抗肿瘤活性
• 1.2.2 抗 HIV 活性
• 1.2.3 其他活性
• 1.3 五环三萜类化合物的生物转化
• 1.3.1 齐墩果烷型五环三萜的微生物转化
• 1.3.2 熊果烷型五环三萜的微生物转化
• 1.3.3 羽扇豆烷型五环三萜的微生物转化
• 1.3.4 五环三萜的非微生物转化
• 1.4 本研究的主要内容和意义
• 第二章 微生物菌株的筛选及产物结构鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 微生物菌种
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 微生物菌株活化
• 2.3.2 微生物菌株的的预培养
• 2.3.3 微生物菌株的筛选
• 2.3.4 薄层层析（TLC）
• 2.3.5 产物的分离纯化
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 微生物的筛选
• 2.4.2 结构分析
• 2.5 小结
• 第三章 座囊霉 HQ316564 催化桦木醇区域选择性氧化合成桦木酮醇的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析
• 3.3.2 培养基初始 pH 值对座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的影响
• 3.3.3 反应温度对座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的影响
• 3.3.4 添加剂 DMSO 的浓度对座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的影响
• 3.3.5 座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的反应历程
• 3.3.6 反应体系对座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的影响
• 3.3.7 经诱导的静息态细胞催化桦木酮醇的合成
• 3.3.8 菌体生物量的测定
• 3.3.9 含 DMSO 介质中桦木醇溶解度的测定
• 3.3.10 菌体胞内桦木酮醇的萃取与检测
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 培养基初始 pH 对座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的影响
• 3.4.2 反应温度对座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的影响
• 3.4.3 添加剂 DMSO 的浓度对座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的影响
• 3.4.4 座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的反应历程
• 3.4.5 反应体系对座囊霉 HQ316564 催化桦木酮醇合成的影响
• 3.5 小结
• 第四章 紫外诱变育种及座囊霉 UV14 催化桦木醇区域选择性氧化合成桦木酮醇的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 出发菌种
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 RP-HPLC 分析和胞内桦木酮醇的萃取与检测
• 4.3.2 致死曲线
• 4.3.3 初筛
• 4.3.4 复筛
• 4.3.5 座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的反应历程
• 4.3.6 预培养时间对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.3.7 离子液体的添加对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.3.8 培养基初始 pH 对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.3.9 反应初始 pH 对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.3.10 预培养温度对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.3.11 反应温度对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.3.12 最适条件下座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的反应历程
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 最适诱变剂量的确立
• 4.4.2 正突变株筛选
• 4.4.3 座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的反应历程
• 4.4.4 预培养时间对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.4.5 离子液体的添加对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.4.6 培养基初始 pH 对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.4.7 反应初始 pH 对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.4.8 预培养温度对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.4.9 反应温度对座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的影响
• 4.4.10 最适条件下座囊霉 UV14 催化桦木酮醇合成的反应历程
• 4.5 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录一 不同菌株转化桦木醇及桦木酸的 TLC 图
• 附录二 标准曲线
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件