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鸭MHCⅡα、β链的克隆和原核表达及其抗体制备

2020-12-03阅读(223)

鸭MHCⅡα、β链的克隆和原核表达及其抗体制备

论文摘要

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）是脊椎动物中发现的编码免疫球蛋白样受体（immunoglobulin-like receptors）的基因群,与机体抗病力和免疫应答相关。MHC据结构与功能可分为MHCⅠ,MHCⅡ和MHCⅢ等三类,MHCⅡ分子呈现在免疫系统特定的细胞表面,由α链和β链非共价键组成的一组高度多态性的跨膜糖蛋白。其中MHCⅡ类分子只表达在有限种类的细胞表面,如包括B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞在内的专职性抗原递呈细胞（APC）以及胸腺上皮细胞和激活的T淋巴细胞,在细胞免疫和体液免疫中起重要作用。MHCⅡ类分子主要是在免疫应答的始动阶段将经过处理的抗原片段递呈给CD4+T细胞。MHCⅡ类分子表达与否及其表达水平,直接决定免疫应答的发生及其强度,其表达水平的改变还参与某些自身免疫病、肿瘤、免疫缺陷等疾病过程的发生和发展,因此它在免疫学上具有重要的研究价值。为了探索鸭MHCⅡ类分子在免疫应答中的作用及其机理,本研究对其进行了克隆、表达及制备了多克隆抗体。首先,据NCBI上已发表的鸭类MHCⅡ的α链和β链基因序列与载体的多克隆酶切位点自行设计两对引物,通过RT-PCR从北京鸭脾脏的总RNA中得到MHCⅡα和MHCⅡβ基因,将其克隆至pMD18-T上,经酶切分析及序列测定后,进一步亚克隆至原核表达载体pET-28a和pGEX-KG上。结果表明:本研究成功克隆了北京鸭MHCⅡα和MHCⅡβ链基因。MHCⅡα大小为633bp,经测序与已登录的基因序列同源性为99%,只有5个核苷酸的差异,导致2个氨基酸的改变;MHCⅡβ大小为798bp,经测序与已登录的基因序列同源性为92%,有61个核苷酸的差异,导致39个氨基酸发生改变。其次,将上述构建成功的原核表达重组质粒pET-28α-α和pGEX-KG-β,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-b-D-galactoside,IPTG）诱导表达,获得了融合蛋白MHCⅡα和MHCⅡβ;对表达条件诱导温度、时间、诱导剂浓度、起始OD600值、通气量、培养基pH及抗生素（Kan和Amp）浓度等进行了优化,得出MHCⅡα融合蛋白在诱导温度为22℃,诱导3h,IPTG浓度为0.05mmol/L,起始诱导OD600值为0.45,通气量70%,pH7.2,Kna 50μg/ml时的表达量最高,而MHCⅡβ融合蛋白的最佳诱导条件是在37℃,诱导3h,IPTG浓度为0.50mmol/L,起始诱导OD600值为0.45,通气量70%,pH5.7,Amp 50μg/ml,表达的融合蛋白均以包涵体形式存在。采用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法纯化了MHCβα和MHCⅡβ包涵体,经过变性和复性,溶解的包涵体通过亲和层析获得了纯度为90%以上的融合蛋白。最后,利用纯化的MHCⅡα和MHCⅡβ融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经酶联免疫吸附实验（ELISA）与免疫印迹法（Western blot）表明,制备的两种多抗均具有良好的抗原性。本研究成功克隆了鸭MHCⅡα和MHCⅡβ基因,构建了原核表达载体,使融合蛋白得到了高效表达,纯化的蛋白经免疫小鼠后制备了效价高、特异性强的多克隆抗体,为深入研究鸭的Ⅱ类MHC基因奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩写词（Abbreviation）
  • 1 文献综述
  • 1.1 MHC的发现和命名
  • 1.2 MHCⅡ的结构和分布
  • 1.2.1 MHCⅡ类分子结构
  • 1.2.2 MHCⅡ分子的分布
  • 1.3 MHCⅡ分子的功能
  • 1.3.1 MHCⅡ类分子的抗原递呈
  • 1.3.2 约束免疫细胞间相互作用
  • 1.3.3 参与对免疫应答的遗传控制
  • 1.3.4 诱导自身或同种淋巴细胞反应
  • 1.3.5 参与T细胞分化过程
  • 1.3.6 γ链的功能
  • 1.4 MHC的遗传特点
  • 1.4.1 单倍型遗传
  • 1.4.2 多态性现象
  • 1.4.3 连锁不平衡
  • 1.5 MHC产物与基因的分型方法
  • 1.5.1 血清学分型
  • 1.5.2 细胞学方法
  • 1.5.3 DNA分型方法
  • 1.6 家禽的MHC研究
  • 1.7 MHC与疾病性状间的关系
  • 1.7.1 BOLA与牛的抗病性
  • 1.7.2 OLA与羊的抗病性
  • 1.7.3 SLA与猪的抗病性
  • 1.7.4 鸡MHC与抗病性的关系
  • 2 研究的目的意义
  • 3 材料与方法
  • 3.1 试验动物
  • 3.2 质粒和菌种
  • 3.3 主要工具酶及试剂
  • 3.4 主要溶液的配制
  • 3.5 主要仪器设备
  • 3.6 鸭MHCⅡ基因cDNA的合成
  • 3.6.1 引物设计
  • 3.6.2 总RNA的提取
  • 3.6.3 鸭cDNA第一链的合成
  • 3.6.4 RT-PCR扩增
  • 3.6.5 RT-PCR产物的回收
  • 3.7 鸭MHCⅡα和β基因的克隆与原核表达载体的构建
  • 3.7.1 回收的DNA片段与克隆载体pMD18-T的连接反应
  • 2法）'>3.7.2 大肠杆菌DH5α或BL21（DE3）感受态细胞的制备（CaCl2法）
  • 3.7.3 连接产物的转化
  • 3.7.4 α互补检查法
  • 3.7.5 重组质粒DNA的提取
  • 3.7.6 重组质粒的鉴定
  • 3.7.7 表达载体pET-28a-α和pGEX-KG-β的构建
  • 3.8 鸭MHCⅡα和β基因的原核表达与鉴定
  • 3.8.1 重组质粒pET-28a-α和pGEX-KG-β的诱导表达
  • 3.8.2 pET-28a-α和pGEX-KG-β融合蛋白的可溶性鉴定
  • 3.8.3 pET-28a-α和pGEX-KG-β诱导表达条件的优化
  • 3.9 融合蛋白的纯化
  • 3.9.1 包涵体的溶解与复性
  • 3.9.2 融合蛋白的纯化
  • 3.10 蛋白浓度的确定
  • 3.11 鼠抗鸭MHCⅡα和β多克隆抗体的制备及鉴定
  • 3.11.1 抗原乳化
  • 3.11.2 鼠抗鸭多抗的制备
  • 3.11.3 免疫血清效价测定
  • 4 结果与分析
  • 4.1 鸭MHCⅡα和β基因的克隆与鉴定
  • 4.1.1 鸭脾脏中的总RNA
  • 4.1.2 RT-PCR扩增的鸭MHCⅡα和β基因
  • 4.1.3 重组质粒的鉴定
  • 4.1.4 重组表达质粒的鉴定
  • 4.2 融合蛋白的提取与鉴定
  • 4.2.1 表达融合蛋白的SDS-PAGE检测
  • 4.2.2 融合蛋白的可溶性鉴定
  • 4.3 融合蛋白的优化与纯化
  • 4.3.1 pET-28a-α和pGEX-KG-β诱导条件优化
  • 4.3.2 融合蛋白的纯化
  • 4.3.3 融合蛋白的浓度
  • 4.4 鼠抗鸭MHCⅡ多克隆抗体的鉴定
  • 5 讨论
  • 5.1 鸭脾脏总RNA的提取及mRNA的反转录
  • 5.3 重组载体的构建
  • 5.4 DNA序列测定
  • 5.5 α和β基因在大肠杆菌BL2（DE3）中的诱导表达
  • 5.6 外源蛋白表达条件的优化
  • 5.6.1 诱导温度对目的蛋白表达量的影响
  • 600值对目的蛋白表达量的影响'>5.6.2 起始诱导OD600值对目的蛋白表达量的影响
  • 5.6.3 培养基的pH值对目的蛋白表达量的影响
  • 5.6.4 诱导时间对目的蛋白表达量的影响
  • 5.6.5 IPTG浓度对目的蛋白表达量的影响
  • 5.6.6 抗生素浓度对目的蛋白表达量的影响
  • 5.7 目标蛋白的分离、复性及纯化
  • 5.8 抗体制备
  • 5.9 下一步计划
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

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