中华绒螯蟹精子顶体反应影响因素及相关蛋白的研究

论文摘要

顶体反应（Acrosome reaction, AR）是受精作用的重要过程,影响AR的因素也将在精卵顺利完成受精作用的过程中起直接作用；AR前和AR过程中的精子膜蛋白（Spermic membrane proteins, SMPs）及顶体反应释放蛋白（Proteins released during AR, PRAs）（包括蛋白水解酶）在维持精子形态结构、新陈代谢和生殖功能中发挥着重要作用,尤其与精卵识别、结合和融合等受精活动密切相关。本文以成熟雄性中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）为实验材料,提取、分离了AR前SMPs （Spermic membrane proteins before AR, SBAs）和AR第三阶段SMPs （Spermic membrane proteins during phase third of AR, SDAs）及PRAs （包括蛋白水解酶）,并通过电泳比较分析其异同,从而推测它们对AR的影响；制备了这三类精子蛋白的抗血清；通过统计分析和光镜观察等手段研究了水化作用、精子悬液密度、胰酶、Ca2+、温度、贮存液成分、冷冻贮存时间等多种理化因素及以上三类精子蛋白的抗血清对精子AR的影响；并在此基础上总结了三种简易高效诱导AR的新方法,即冷冻法、胰酶-Ca2+法和抗血清法。首先,通过分级分离的方法,从中华绒螯蟹的精荚中分离到游离精子。然后分别研究了水化作用、精子悬液密度、胰酶、Ca2+、温度、低温贮存对精子AR的影响。结果显示,AR前精子存在从未发生水化作用到发生水化作用的阶段性过程；高密度精子悬液下所得精子全部发生AR但处于反应的第二阶段,无Ca2+人工海水（Calcium-free artificial sea water, Ca2+-FASW）中的低密度精子未发生反应,而人工海水（Artificial sea water, ASW）中的低密度精子有一些发生了反应,说明精子悬液密度明显影响AR；胰酶加Ca2+和低温可高效诱导精子发生AR且低温诱导不需要Ca2+, AR时间只与贮存时间有关。第二,用冷冻法诱导精子发生AR,分离提取了PRAs包括蛋白水解酶；经反复冻融和离心法制备了SBAs和SDAs。并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native polyacrylamide gel electrophoresis, Native-PAGE）比较了AR释放的蛋白水解酶、AR前和AR过程中的精子内蛋白水解酶的异同。结果显示,AR前和AR过程中的精子蛋白及PRAs中先后出现12种活性蛋白水解酶,有些是AR前已具有的并一直保持着较高的活性或逐渐减少乃至消失,有些水解酶活性是AR过程中产生的并持续到反应结束或逐渐提高,尤其在PRAs中达到最高。又通过SDS（十二烷基磺酸钠）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）和Naive-PAGE比较了以上各种蛋白的电泳图谱,结果显示,SMPs在AR前后有一些变化,且PRAs中也有SMPs组分。第三,利用提取分离的SBAs和SDAs及PRAs免疫小鼠,制备抗血清。然后又利用双向扩散对抗血清的效价和特异性进行了检测。结果显示,SBAs和SDAs及PRAs的抗血清的效价分别为1：8、1：8和1：32,且都能与精巢、输精管和贮精囊等组织粗提液形成沉淀线,三类蛋白都存在于以上三种组织中,而不存在于雄性中华绒螯蟹的血清中。用这三类抗血清分别与精子共孵,发现SBAs抗血清能高效诱导精子发生AR并达到反应的第4阶段,且反应精子外形轮廓清晰,证明该法既可以作为AR的高效诱导方法,又可以作为观察AR精子形态的有效手段。从以上实验可以看出,AR前中华绒螯蟹精子存在水化作用阶段,机械性挤压和低温（或温差）是AR的重要诱因,Ca2+对AR的外部诱导物胰酶具有激活作用；Ca2+-FASW低密度（5×106个mL）机械匀浆法和胰酶法可获得高质量不反应精子,冷冻法、胰酶-Ca2+法和抗血清法可高效诱导AR；有多个实验证据表明中华绒螯蟹精子存在获能阶段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 研究现状
• 1.1.1 中华绒螯蟹精子及顶体的结构
• 1.1.2 中华绒螯蟹精子的AR及精子的质量评价
• 1.1.2.1 受精作用和AR
• 1.1.2.2 AR的诱导及精子的质量评价
• 1.1.2.3 AR的影响因素
• 1.1.3 精子的获能
• 1.1.4 甲壳动物精子的顶体蛋白
• 1.1.5 SMPs
• 1.2 研究的目的和意义
• 第2章 几种理化因素对中华绒螯蟹精子AR的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 药品与试剂
• 2.2.4 方法
• 2.2.4.1 水化作用对AR的影响
• 2.2.4.2 精子悬液密度对AR的影响
• 2.2.4.3 胰酶对AR的影响
• 2.2.4.4 温度对AR的影响
• 2.2.4.5 超低温贮存对AR的影响
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 精子水化作用对AR的影响
• 2.3.2 精子悬液密度对AR的影响
• 2.3.3 胰酶对AR的影响
• 2.3.4 温度对AR的影响
• 2.3.5 超低温贮存对AR的影响
• 第3章 AR中中华绒螯蟹精子蛋白的变化
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器与设备
• 3.2.3 药品与试剂
• 3.2.4 方法
• 3.2.4.1 AR中精子蛋白水解酶变化的检测
• 3.2.4.2 SMPs和PRAs的检测
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 AR中精子蛋白水解酶变化的检测
• 3.3.2 AR过程中的SMPs和PRAs的电泳检测
• 第4章 三类精子蛋白抗血清的制备、检验及对AR的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器与设备
• 4.2.3 药品与试剂
• 4.2.4 方法
• 4.2.4.1 精子的获得和三类精子蛋白的提取和粗分离
• 4.2.4.2 三类精子蛋白抗血清的制备
• 4.2.4.3 三类抗血清的活性和效价检验
• 4.2.4.4 双向免疫扩散检验三类抗血清的特异性
• 4.2.4.5 三类抗血清对精子AR的影响
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 三类抗血清的活性和效价检验
• 4.3.2 三类抗血清特异性的检验
• 4.3.3 三类抗血清对精子AR的影响
• 第5章 结语
• 参考文献
• 致谢
• 图版说明
• 图版
• 缩略词