甘蔗MYB转录因子生物信息学分析、基因克隆与表达

论文摘要

转录因子（Transcription factor, TF）也称反式作用因子,是一类能够与基因启动子区域中顺式作用元件、沉默子或增强子发生特异性结合并相互作用,从而激活或者抑制目的基因转录和翻译的DNA结合蛋白。前人研究显示MYB转录因子对应答植物逆境胁迫等有重要作用,甘蔗MYB转录因子的研究并不太多。为此,在导师主持的国家“948’颂目（2010-C21）和国家现代产业技术体系建设专项资金项目的支持下,本研究利用甘蔗EST数据库、基因数据库和蛋白质数据库信息,应用电子克隆技术获得甘蔗MYB转录因子家族基因21条,选择其中3个甘蔗转录因子基因进行详细的生物信息学分析,并通过RT-PCR技术进行实验克隆,验证电子克隆所获得序列的正确性;同时,对甘蔗MYB18转录因子基因进行定量PCR和原核表达分析,以期探讨该基因的功能,并为基因功能解析提供核心技术,也为发掘甘蔗源功能基因用于甘蔗抗逆性改良奠定基础,因此,课题研究有重要的实际价值和理论意义。本研究的主要结果和结论如下：1.利用甘蔗EST数据,通过电子克隆的方法获得21条甘蔗MYB转录因子家族基因的cDNA序列,并应用生物信息学软件对获得的序列进行了疏水性、等电点、二级和三级结构预测等生物信息学分析,结果显示通过电子克隆获得的21条序列都包含着MYB类转录因子基因的典型结构域特点,17个为R2R3结构域,仅1个为R3结构域,还有3个不明确。2.通过RT-PCR的方法,获得了MYB18和MYB59基因的cDNA全长序列,长度分别为1599bp和969bp,验证了电子克隆所获得的甘蔗MYB转录因子基因的正确性；采用基因多重比较方法,比较了与甘蔗近缘物种的MYB转录因子的同源性,并形成进化树,这两个基因与玉米等物种的MYB基因有着很高的相似性。为分析基因的结构,本研究还克隆了甘蔗MYB18和MYB59转录因子基因的基因组DNA序列,通过与其相应的cDNA序列比较,进行了外显子和内含子结构分析,明确了这两个基因均含有两个内含子,其中MYB18基因的内含子分别为116bp和92bp,MYB59基因的内含子分别为97bp和88bp,研究结果为进一步的功能分析奠定了基础。3.通过对与甘蔗亲缘关系近的禾本科作物玉米、高粱和水稻MYB转录因子基因家族的密码子使用偏好性进行比较分析,结果表明三个物种的MYB转录因子的蛋白质序列上存在高度的保守性,仅有部分密码子使用不太一样,例如,在缬氨酸（Val）编码上,玉米偏爱用GUC编码,而高粱则是GUG,水稻除了GUC还偏爱用GUG编码；在苏氨酸（Thr）编码上,水稻偏好于ACG编码,而高粱和玉米则有ACG和ACC两种偏好编码方式。此外,分析还显示基因碱基组成有可能在一定程度上影响了密码子的偏向使用。以上结果为甘蔗中MYB转录因子家族基因的功能预测,也即不同MYB家族成员之间的相互作用分析奠定了一定的理论基础。4.利用实时荧光定量PCR和原核表达分析,初步研究了甘蔗MYB18转录因子基因的功能。定量PCR表达分析结果显示,甘蔗MYB18转录因子基因的表达受NaCK、H2O2和PEG胁迫的抑制,该基因可能在甘蔗的抗病和抗盐碱胁迫机制中发挥着某种作用。此外,本研究还构建了甘蔗MYB18基因的原核表达载体pET28-Myb18,通过比较E.coli空菌（Mock） pEG-28a（-）和pET28-Myb18菌株在IPTG诱导下,特定蛋白的表达情况,明确了MYB18基因能在原核生物Rosetta（DE3）中表达特异蛋白,实现了目的基因在原核生物中的大量表达。进一步利用His标签方法,获得了MYB18蛋白较纯品。结果为进一步研究该蛋白对下游效应基因的调控,也为利用甘蔗源功能基因改良甘蔗抗逆性状奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 EST序列分析
• 1.2 电子克隆
• 1.3 植物MYB类转录因子研究进展
• 1.3.1 MYB类基因的结构特征及分类
• 1.3.2 植物MYB类转录因子的功能特点
• 1.4 同义密码子使用偏好性分析
• 1.5 立题依据、目的和意义
• 第二章 甘蔗MYB转录因子基因的预测和生物信息学分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 电子克隆获得新基因序列
• 2.1.2 生物信息学分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 甘蔗MYB类转录因子基因的分类
• 2.2.2 甘蔗MYB2转录因子基因的电子克隆与生物信息学分析
• 2.2.2.1 甘蔗MYB2蛋白疏水性/亲水性分析
• 2.2.2.2 甘蔗MYB2蛋白的等电点和分子量预测
• 2.2.2.3 甘蔗MYB2蛋白二级结构预测
• 2.2.2.4 甘蔗MYB2蛋白结构域分析及功能预测
• 2.2.2.5 甘蔗MYB2蛋白结构域三维结构预测
• 2.2.2.6 甘蔗MYB基因进化树分析
• 2.2.3 甘蔗MYB18转录因子基因的电子克隆与生物信息学分析
• 2.2.3.1 甘蔗MYB18蛋白疏水性/亲水性分析
• 2.2.3.2 甘蔗MYB18蛋白的等电点和分子量预测
• 2.2.3.3 甘蔗MYB18蛋白二级结构预测
• 2.2.3.4 甘蔗MYB18蛋白三维结构预测
• 2.2.4 甘蔗MYB59转录因子基因的电子克隆与生物信息学分析
• 2.2.4.1 甘蔗MYB59蛋白疏水性/亲水性分析
• 2.2.4.2 甘蔗MYB59蛋白的等电点和分子量预测
• 2.2.4.3 甘蔗MYB59蛋白二级结构预测
• 2.2.4.4 甘蔗MYB59蛋白质结构分析与功能预测
• 2.2.4.5 甘蔗MYB59蛋白三维结构预测
• 2.2.5 甘蔗MYB基因进化树分析
• 2.3 讨论与结论
• 第三章 甘蔗MYB18和MYB59基因的实验克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 主要试剂
• 3.1.1.3 主要仪器和设备
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 总RNA的提取
• 3.1.2.2 第一链cDNA的制备
• 3.1.2.3 基因组DNA的提取
• 3.1.3 引物设计
• 3.1.4 RT-PCR反应体系和程序
• 3.1.5 PCR反应体系和程序
• 3.1.6 PCR产物电泳检测
• 3.1.7 目的片段的回收
• 3.1.8 目的片段的克隆与测序
• 3.2. 结果与分析
• 3.2.1 斑茅蔗MYB18和MYB59转录因子的cDNA序列克隆
• 3.2.2 斑茅蔗MYB18和MYB59转录因子的基因组序列的克隆
• 3.2.3 斑茅蔗MYB18和MYB59转录因子的基因结构分析
• 3.2.4 甘蔗MYB18和MYB59转录因子基因的同源性分析
• 3.3 讨论与结论
• 第四章 MYB转录因子的同义密码子使用偏好性分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 序列数据
• 4.1.2 分析方法
• 4.1.2.1 对应性分析
• 4.1.2.2 密码子相对实用度的估算
• 4.1.2.3 最优密码子的确定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 MYB基因的碱基组成
• 4.2.2 MYB基因密码子的对应性分析
• 4.2.3 最优密码子的确立
• 4.3 讨论与结论
• 第五章 甘蔗MYB18转录因子功能的初步鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料及其处理
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 RNA提取及第一链cDNA的合成
• 5.1.2.2 定量PCR分析
• 5.1.2.3 甘蔗MYB18转录因子基因的原核表达载体构建
• 5.1.2.4 甘蔗MYB18转录因子基因的原核表达分析方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 甘蔗MYB18转录因子基因的定量PCR表达分析
• 5.2.2 甘蔗MYB18转录因子基因的原核表达载体构建与诱导表达
• 5.3 讨论与结论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢