电喷雾质谱法定性定量研究细胞色素C及其非共价键复合物

论文摘要

本论文主要采用电喷雾质谱法对细胞色素C及其非共价键复合物进行定性和定量研究。因电喷雾质谱法具有多电荷能力,所以其在分析大分子物质方面有着独特的优势。此外,电喷雾质谱法所具有的快速、特异性、灵敏的特点促使其在众多学科和领域中得到广泛应用。电喷雾质谱法作为一种软电离方式,其对于非共价键复合物的研究有着不可替代的地位。其不仅能够在比较温和的条件下保持复合物结构的稳定性,而且能够容易得出非共价键复合物的分子量、化学计量比等具体信息。在电喷雾质谱法中,待测样品信号强度受仪器参数的影响比较明显。合适的参数条件不仅要求样品的信号强度要足够强,而且还需尽可能选择较温和的条件,这样有助于保持蛋白质及非共价键复合物的天然构型。本课题考察各个仪器参数对信号强度的影响,探索获得了研究细胞色素C复合物的最佳实验条件。并且利用改变碰撞电压的方法,通过二级质谱证明了细胞色素C中血红素与氨基酸残基的结合方式是以稳定的共价键形式存在。本文选取三类不同的小分子物质（皂苷、寡糖和三萜）与细胞色素C混合并运用ESI-MS来检测是否形成非共价键复合物。通过实验结果证明细胞色素C能与皂苷（柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、人参皂苷Re）形成非共价键复合物;根据皂苷在分子结构上是由寡糖和三萜两部分构成,先后选择三种寡糖（水苏糖、绵子糖、麦芽三糖）和三种三萜（甘草次酸、齐墩果酸、熊果酸）与细胞色素C进行混合,根据质谱检测出结果显示三种寡糖都能与细胞色素C形成非共价键复合物;而检测结果未观察到三种三萜与细胞色素C形成的非共价键复合物。上述研究说明在与细胞色素C形成非共价键复合物的过程中,皂苷的有效结合区域在寡糖部分而非三萜部分。本课题是已知目前首次采用电喷雾质谱法研究寡糖作为配体与细胞色素C形成的非共价键复合物,证明了电喷雾质谱法在对细胞色素C及其非共价键复合物的研究方面所具有的独特优势,而且为细胞色素C非共价键复合物的配体选择方面提供了新的思路。本课题不但通过定性研究证明了皂苷和寡糖都能与细胞色素C形成非共价键复合物,而且通过特定的直接计算法对所形成的非共价键复合物的稳定性进行了定量计算。本课题中采用特定的直接计算法,计算出皂苷（柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、人参皂苷Re）、寡糖（水苏糖、绵子糖、麦芽三糖）分别与细胞色素C形成的1:1、1:2非共价键复合物的解离常数Kd1、Kd2,并根据解离常数大小比较了皂苷、寡糖分别与细胞色素C形成非共价键复合物的稳定性的相对大小。本课题通过直接实验法来探究细胞色素C与配体分子的结合部位和作用方式;根据计算所得的解离常数,并结合配体结构和已知的文献,我们对于各种配体形成非共价键复合物的稳定性差别给予了详细、明确的解释。根据质谱检测结果和配体的结构以及相关的参考文献,得知配体与细胞色素C是以氢键的形式形成了非共价键复合物。配体分子中羟基的个数对非共价键复合物的稳定性具有重要的正相关性;此外,配体结构以及空间位阻对于非共价键复合物的形成也是有一定的影响。不同于文献报道的理论计算法,本实验课题采用细胞色素C作为模型分子进行电喷雾质谱检测,并选择配体分子与之形成非共价键复合物。本论文分析了细胞色素C非共价键复合物成键的方式,以及影响非共价键复合物稳定性的因素。本课题不但为选择新的配体与细胞色素C结合提供了一个新的思路,也进一步验证了ESI-MS是一种有效研究蛋白质非共价键复合物的分析手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 质谱法简述
• 1.2 ESI-MS 对蛋白质非共价键复合物的研究
• 1.2.1 蛋白质非共价键复合物的研究方法
• 1.2.2 ESI 基本原理及特点
• 1.2.3 ESI-MS 研究蛋白质非共价键复合物的实验条件
• 1.2.4 ESI-MS 在研究蛋白质非共价键复合物中的应用
• 1.3 细胞色素 C 的结构与功能
• 1.4 本课题所研究的细胞色素C 配体分子的药效和性质
• 1.5 本课题意义
• 1.6 本课题具体研究工作的内容
• 第2章 细胞色素C 的ESI-MS 研究
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 安捷伦 6520 Accurate-Mass Q-TOF 1200 LC/MS 仪器结构
• 2.1.3 Syringe pump
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 仪器参数
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 溶液制备
• 2.2.2 ESI-MS 检测条件的优化
• 2.2.3 碰撞能量
• 2.3 本章小结
• 第3章 运用ESI-MS 研究细胞色素C 与皂苷的非共价键复合物
• 3.1 仪器与试剂
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器参数
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 溶液制备
• 3.2.2 ESI-MS 检测
• 3.2.2.1 细胞色素 C 和柴胡皂苷 C 混合后的质谱图
• 3.2.2.2 细胞色素 C 和柴胡皂苷 A 混合后的质谱图
• 3.2.2.3 细胞色素 C 和人参皂苷 Re 混合后的质谱图
• 3.3 本章小结
• 第4章 运用 ESI-MS 研究细胞色素C 与寡糖的非共价键复合物
• 4.1 仪器与试剂
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器参数
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 样品制备
• 4.2.2 ESI-MS 检测
• 4.2.2.1 细胞色素 C 与绵子糖混合后的 ESI-MS 检测
• 4.2.2.2 细胞色素 C 与水苏糖混合后的 ESI-MS 检测
• 4.2.2.3 细胞色素 C 与麦芽三糖混合后的 ESI-MS 检测
• 4.2.2.4 细胞色素C 与三萜混合后的质谱图
• 4.3 本章小结
• 第5章 直接计算法计算细胞色素C 非共价键复合物的解离常数Kd
• 5.1 解离常数Kd
• 5.2 直接计算法
• 5.3 计算结果
• 5.4 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录A： 攻读硕士学位期间发表的论文目录