金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清制备及在内分泌扰乱化学物质检测中的应用

论文摘要

自1990年代以来,世界各国开始重视内分泌扰乱化学物质的研究,并建立了多种以鱼类（如Medaka、Fatheadminnow和Zebrafish等）为模式生物的活体（invivo）筛选技术,而我国目前还没有建立以本土鱼类为模式生物的活体筛选系统。因而,本文选择以在我国广泛分布的观赏性鱼类――金鱼作为模式生物,在制备兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的基础上,开发了定性检测金鱼卵黄原蛋白的western-blot技术;并首次建立了以雄性金鱼卵黄原蛋白诱导产生为主要指标,以γ-谷胺酰转移酶和乳酸脱氢酶为辅助指标的环境雌激素筛选的指标体系,并成功地应用在多种农药的环境雌激素活性的检测中。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性金鱼血浆中分离、纯化了金鱼卵黄原蛋白,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为卵黄原蛋白,该卵黄原蛋白在非变性条件下分子量约为440kDa,在SDS变性条件下分子量约为84和60kDa。并利用分离、纯化的金鱼卵黄原蛋白,制备了兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清,开发了检测金鱼卵黄原蛋白的western-blot技术,1:2000倍稀释的多克隆抗血清对金鱼卵黄原蛋白的最低检出限为0.5mgL-1。用0.05mgg-1BW的17β-雌二醇腹膜注射雄性金鱼,诱导14d后尾静脉取血,对血浆western-blot检测结果表明,17β-雌二醇能够诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的产生;且17β-雌二醇暴露造成了金鱼肝细胞核膨胀,脂滴大量积累,精巢内生精细胞团萎缩、纤维化,精子密度降低。以雌性类固醇激素17β-雌二醇对雄性金鱼的雌激素作用为客观参照,用0.01,0.1和1.0mgL-1久效磷暴露雄性金鱼21d,雄性金鱼血浆western-blot检测结果表明3个暴露浓度的久效磷均能诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的产生;3个暴露浓度的久效磷均造成了雄性金鱼生殖腺指数、单

论文目录

• 0 前言
• 1 鱼类卵黄原蛋白分离纯化、检测技术及环境雌激素作用途径研究进展
• 1.1 鱼类卵黄原蛋白分离纯化、检测技术
• 1.2 环境雌激素类化合物作用途径研究
• 1.3 研究展望
• 2 金鱼卵黄原蛋白的分离纯化及性质鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与分析
• 2.3 讨论
• 3 金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的制备及鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 4 E2诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的分泌
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 5 久效磷诱导雄性金鱼分泌卵黄原蛋白的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 6 多种农药的环境雌激素活性的筛选
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果与分析
• 6.3 讨论
• 7 鲫鱼和鲤鱼卵黄原蛋白的分离纯化及与兔抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的交叉反应
• 7.1 材料与方法
• 7.2 结果与分析
• 7.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录