stathmin siRNA表达载体对MCF-7细胞生物学行为的影响

论文摘要

微管是真核生物细胞骨架非常重要的成分,行使许多功能,例如：胞内物质运输、蛋白合成、细胞内信号转导和有丝分裂时染色体的分离,并决定细胞的生存。微管在心肌细胞中还有一些特殊的作用,包括调节肌小节的收缩、离子通道和受体再循环以及调节肌小节的结构。细胞内微管经常处于聚合和解聚两种状态的动态平衡中,主要有两种微管调节蛋白参与微管聚合和解聚之间的转变：一种是微管相关蛋白,即MAPs,它使微管处于稳定或聚合状态；另一种是Op18/stathmin家族成员,它们使微管处于不稳定或解聚状态。stathmin,也被称为癌蛋白18（Op18）、p18、p19、19K、metablastine、Lap18、prosolin、和pp21/pp23。stathmin是普遍存在的分子量为18kDa的胞质蛋白,它通过分解微管和／或促进微管突变而使微管处于不稳定的状态。stathmin首先在白血病中被鉴定为一种磷酸化蛋白,而后发现在增生性的乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌细胞中高表达,stathmin在p53突变的乳腺癌细胞株中也高表达。因此,我们推测用siRNA抑制stathmin的表达可能会影响乳腺癌MCF-7细胞株的增殖、凋亡和转移,以及微管的形态。我们首先构建stathmin siRNA表达载体,转染乳腺癌MCF-7细胞,观察GFP蛋白表达证实转染效率,以RT-PCR和Western Blot检测stathmin siRNA表达载体在mRNA和蛋白水平对乳腺癌MCF-7stathmin表达的影响。实验发现stathmin siRNA表达载体能够抑制乳腺癌MCF-7 stathmin的表达。然后,我们用MTS实验去检测stathmin siRNA表达载体对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响,我们发现转染了stathmin siRNA表达载体的乳腺癌MCF-7细胞组的增殖受到了一定的抑制。接下来,我们用AO／EB和Western Blot分别从形态学和蛋白水平去探讨stathmin siRNA表达载体对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。实验证明,转染了stathmin siRNA表达载体的乳腺癌MCF-7细胞组的细胞凋亡增加,而且细胞凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9表达增加。然后,为了了解stathmin siRNA表达载体对乳腺癌MCF-7细胞迁移的影响,我们采取了划痕实验,发现stathmin siRNA表达载体能够抑制乳腺癌MCF-7细胞的迁移。最后,通过间接免疫荧光探讨stathmin siRNA表达载体对乳腺癌MCF-7细胞微管形态的影响。我们发现在乳腺癌MCF-7细胞中,转染了空白载体和无意义载体的对照组中,表现为短而弥散的微管,但转染了stathmin siRNA表达载体组中,表现为长而成束状的微管,而且聚合性微管荧光强于对照组。以上研究结果表明,stathmin siRNA表达载体能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞中stathmin的表达,从而抑制细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡和微管的聚合。因此,沉默stathmin可以作为乳腺癌基因治疗的一个潜在靶标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写注解（Alphaetic）
• 第一章 前言
• 第二章 材料
• 第三章 主要方法
• 第四章 结果
• 4.1 MCF-7细胞质粒转染效率
• 4.2 stathmin siRNA质粒使MCF-7细胞内stathmin mRNA和蛋白表达下降
• 4.3 stathmin siRNA质粒抑制MCF-7细胞的增殖
• 4.4 stathmin siRNA质粒促进MCF-7细胞的凋亡
• 4.5 stathmin siRNA质粒明显上调MCF-7细胞内凋亡蛋白的表达
• 4.6 stathmin siRNA质粒能够影响微管的形态
• 4.7 stathmin siRNA质粒抑制MCF-7细胞的迁移
• 第五章 分析与讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的主要研究成果