Cre/LoxP增强特异性启动子诱导的自杀基因抑制晶状体上皮细胞增殖的实验研究

论文摘要

第一部分增强型特异性表达载体组合的构建、病毒包装和纯化目的构建由Cre/LoxP介导的增强型特异性表达载体组合（包含调控载体Lenti-LEP503-HSVtk-Cre和靶载体Lenti-HPGK-Loxp-EGFP-pA-Loxp-HSVtk）,即增强型慢病毒介导人晶状体上皮细胞（HLEC）特异性启动子LEP503诱导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷（HSV-tk/GCV）系统,以建立高效特异的慢病毒转基因平台。方法利用分子克隆技术,用PCR方法从Lenti-Cre中克隆Cre酶,亚克隆至T载体,经EcoRI和SalI双酶切,同时质粒Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP经EcoRI和SalI双酶切,定向连接得调控载体Lenti-LEP503-HSVtk-Cre;人工合成片段Loxp-polyA-Loxp,polyA前含PmeI酶切位点,与T载体连接后,插入两端含pmeI酶切位点的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）全序列引物扩增的片段,形成Loxp-EGFP-pA-Loxp载体,与质粒PRRL一起经BamHI和SalI双酶切,定向连接。PCR方法克隆IRES-HSVtk,两端含SalI酶切位点,与上述构建好的载体用SalI酶切,连接形成靶载体Lenti-HPGK-Loxp-EGFP-pA-Loxp-HSVtk。利用慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,包装病毒并收集上清液中病毒颗粒,感染HLECs,荧光显微镜观察EGFP表达,RT-PCR和Western blot检测HLECs中HSV-tk在mRNA水平和蛋白水平上的表达。结果增强型特异性表达载体组合可在部分HLECs中表达EGFP。RT-PCR检测HSV-tk mRNA高表达。Western blot检测:Cre蛋白量与调控载体表达相似,EGFP蛋白表达量少于靶载体,HSV-tk蛋白表达量多于调控载体。结论成功构建Cre/LoxP介导的增强型特异性表达载体组合（包含调控载体Lenti-LEP503-HSVtk-Cre和靶载体Lenti-HPGK-Loxp-EGFP-pA-Loxp-HSVtk）,并能包装出稳定高效的病毒,感染HLECs后得到高表达的HSV-tk蛋白,Cre/LoxP作用得到很好体现,为下一步感染并抑制HLECs的增殖实验提供可靠的慢病毒转基因技术平台。第二部分增强型特异性表达载体组合/GCV系统抑制晶状体上皮细胞增殖的实验研究目的探讨增强型特异性表达载体组合/GCV系统能否高效抑制HLECs增殖作用。方法试验组为增强型特异性表达载体组合、调控载体、靶载体、广谱表达载体（Lenti-HPGK-EGFP-HSVtk）、特异性表达载体（Lenti-LEP503-EGFP-HSVtk）感染的HLECs;仅表达EGFP的慢病毒（Lenti-IRES-EGFP）感染HLECs为阴性对照组。各载体感染HLECs后,在不同浓度的GCV作用下,荧光显微镜、流式细胞仪和电镜观察HSV-tk/GCV系统对HLECs的杀伤作用;细胞计数试剂盒（CCK-8）检测HSV-tk/GCV系统的浓度与时间依赖性。结果增强型特异性表达载体组合感染HLECs后,在GCV作用下荧光显微镜观察和CCK-8试剂盒检测GCV对HLECs的杀伤作用随时间延长和浓度增强而加强。20μg/ml GCV对HLECs的杀伤作用较强,同时存在明显的旁观者效应且对HLECs毒性低,其抑制HLEC的增殖效应优于调控载体,但弱于广谱表达载体。GCV浓度＞20μg/ml时,由于GCV的自身毒性阴性对照组细胞的增殖也被受到抑制。20μg/ml GCV作用96小时后流式细胞仪检测:广谱表达载体HLEC杀伤率为93.28%;调控载体为48.58%;特异性表达载体为53.2%;阴性对照组为0.96%;增强型特异性表达载体组合共感染细胞的杀伤效率为75.65%。结论增强型特异性表达载体组合在GCV作用下能高效抑制HLECs的增殖。当GCV浓度为10～20μg/ml时,GCV对感染细胞有明显的增殖抑制作用,且随浓度的升高和时间的延长作用增强,20μg/mlGCV抑制作用更明显且GCV本身对HLECs毒性低。第三部分增强型特异性表达载体组合在晶状体上皮细胞中的组织特异性表达研究目的研究增强型特异性表达载体组合在HLEC中的特异性表达以及GCV作用后对其他细胞的毒性作用。方法分别以HLEC,视网膜色素上皮细胞（RPEC）、小鼠成纤维细胞（NIH3T3）,人胚肾细胞（293T）为实验组,转入增强型特异性表达载体组合,三天后荧光显微镜观察四组细胞荧光强度,并收集HLECs和RPECs作RT-PCR检测HSV-tk的表达差异,判断其特异性表达情况。20μg/ml GCV作用72、96小时后,CCK—8试剂盒和流式细胞仪检测HSV-tk/GCV系统对HLECs和RPECs的杀伤作用。结果增强型特异性表达载体组合在NIH3T3、293T、RPECs中均表达EGFP;在HLECs中弱表达EGFP。RT-PCR检测结果显示HLECs内有较高的HSV-tk表达,20μg/ml GCV作用96小时后流式细胞仪检测:HLEC组的细胞杀伤效率为76.51%,而RPEC组仅为2.24%。CCK-8试剂盒检测细胞的增殖抑制情况显示:20μg/ml GCV作用72小时后增强型特异性表达载体组合感染的RPEC活性与正常RPE组和阴性对照RPE组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）;但与广谱表达载体组比较,广谱表达载体组RPECs活性明显抑制,两者相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论增强型特异性表达载体组合能在HLEC中特异性表达HSV-tk,GCV作用后可选择性抑制HLECs增殖,但对RPECs无明显杀伤作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 增强型特异性表达载体组合的构建、病毒包装和纯化
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分 增强型特异性表达载体组合/GCV系统抑制晶状体上皮细胞增殖的实验研究
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分 增强型特异性表达载体组合/GCV系统在晶状体上皮细胞中的组织特异性表达研究
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录一
• 综述1 HSV—tk/GCV自杀基因系统抑制晶状体后囊膜混浊的研究进展
• 综述2 PAI-1在早期晶状体后囊膜混浊发生中的作用
• 附录二 缩略语
• 附录三 在读期间发表文章、奖励和科研项目
• 致谢