微阵列制备及M.fulvus HW-1耐盐相关基因表达谱分析

论文摘要

由于早先大部分粘细菌是从土壤环境中分离的，并且不能够在海水盐浓度下生长，所以粘细菌曾被普遍认为是典型的陆生细菌。然而随着分子生物学技术的发展，有研究人员利用16S rRNA基因文库技术在海洋沉积物中发现了粘细菌相关序列的存在，并于1998年起成功从海洋环境中分离出了不少耐盐和嗜盐粘细菌菌株。Myxococcus fulvus HW-1（ATCC BAA-855）是本实验室从海水样品中分离得到的一株海洋粘球菌，它能够在0-130％的海水浓度的培养基上生长，最适生长浓度为0-80％的海水培养基。M．fulvus HW-1在海水条件下表现出特殊的细胞行为，如不依赖于细胞密度生长，不依赖于子实体形态发生的粘孢子形成等。双组分系统是一类广泛存在于原核生物中的信号转导途径，通过调控基因表达使得生物体可以对变化的生活环境产生适应性应答，在细胞感应渗透胁迫过程中起到了重要的作用，并且在粘细菌的生长、发育及社会性运动的信号传导和调节过程中，也广泛存在着双组分系统。我们可以推断，双组分系统在M．fulvus HW-1适应海洋环境中起到了重要的调控作用——在双组分系统的调控下，一些外膜蛋白（如：如K+通道蛋白、与亲水性的小分子物质吸收排出相关的孔道蛋白等）数量上发生变化，从而调节膜对盐离子的通透性，起到调节渗透压的作用。为了证实以上推论，我们采用了表达谱分析法来研究M．fulvus HW-1在海水、淡水两种环境下这些基因表达的差异，以揭示双组分系统和外膜蛋白等在粘细菌适应海洋环境过程中起到的作用。以M．xanthus DK1622的不完整基因组序列为材料，使用Glimmer软件预测获得了9314个ORFs，经过进一步剔除一些不符合生物学特征的ORFs后，最终获得了7885个ORFs。再利用TMHMM、SignalP、PSORTb及SMART等工具预测了这7885个ORFs可能的拓扑结构、亚细胞定位以及功能结构域，筛选获得了386个芯片制备候选基因，其中包括可能的233个双组分系统、82个外膜蛋白、20个胞外蛋白以及51个胞周间隙蛋白基因。利用Array Designer v3.01软件对386个候选基因的PCR扩增引物进行了批量设计，根据理想参数进行挑选，共成功获得360条靶基因的引物序列，其中包括双组分系统基因226个，外膜蛋白基因74个，胞外蛋白基因18个，胞周间隙蛋白基因42个。此外，我们还加入了60个已知的可能与粘细菌运动相关的基因。我们以DK1622基因组DNA为模板，成功扩增出了411个靶基因片段作为微阵列固定探针，并设计制备了一个含有上述探针的低密度芯片。通过M．xanthus DK1622和M．fulvus HW-1基因组DNA芯片共杂交实验，我们证明了此芯片不仅质量可靠，而且也可用于HW-1菌株的基因表达谱研究。经过大量的反复试验探索，确定了提取样品RNA的最佳菌体状态、最佳提取环境及相关步骤后，我们分析了M．fulvus HW-1在淡水和海水培养条件下的表达谱差异，得到了94个差异表达的基因：在海水中上调表达的基因有10个，其中有6个双组分系统、1个外膜蛋白、2个胞外蛋白和1个周质蛋白；在淡水中上调表达的基因有84个，其中有29个双组分系统、19个外膜蛋白、5个胞外蛋白、14个周质蛋白和17个粘细菌运动相关基因。通过综合分析各个基因的预测功能和表达差异度，我们从这些差异表达基因中挑选出双组分系统基因T105和外膜蛋白基因OM031，利用实时荧光定量PCR技术检测验证了这两个基因的微阵列数据的可靠性，并将通过建立相关基因缺失突变株来进行功能验证。目前，我们已经成功地构建了缺失载体，后续工作正在开展中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1.1 DNA微阵列技术简介
• 1.1.1 DNA微阵列的分类
• 1.1.2 DNA微阵列在细菌研究中的应用
• 1.1.3 DNA微阵列的技术流程
• 1.1.3.1 微阵列的制备
• 1.1.3.2 分析样本制备
• 1.1.3.3 微阵列杂交
• 1.1.3.4 信号检测分析
• 1.1.4 DNA微阵列的数据分析
• 1.1.4.1 芯片数据的归一化处理
• 1.1.4.2 DNA微阵列的数据挖掘
• 1.1.5 DNA微阵列的数据验证及差异表达基因的功能验证
• 1.2 粘细菌概论
• 1.3 海洋粘细菌M.fulvus HW-1的基本性质
• 1.4 双组分系统与外膜蛋白在渗透调节中的作用
• 1.4.1 双组分系统
• 1.4.1.1 双组分系统在渗透调节中的作用
• 1.4.1.2 双组分系统在粘细菌中的作用
• 1.4.2 外膜蛋白在渗透调节中的作用
• 1.5 本文工作开展的思路
• 第二部分 粘细菌基因组序列分析
• 2.1 实验材料和所用软件
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 所用软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 M.xanthus DK1622基因组开放阅读框（Open Reading Frames,ORFs）的识别
• 2.2.2 基于序列相似性的基因功能预测
• 2.2.3 基于结构域特征的基因功能预测
• 2.2.4 靶基因的选择与引物设计
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 M.xanthus DK1622基因组ORFs的识别
• 2.3.2 基于结构域特征的基因产物功能预测
• 2.3.2.1 外膜、胞周间隙及胞外蛋白基因的预测
• 2.3.2.2 双组分系统相关基因的预测
• 2.3.3 引物设计
• 2.4 小结
• 第三部分 粘细菌DNA微阵列的制备
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂与试剂盒
• 3.1.4 实验器材与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粘细菌基因组DNA的提取
• 3.2.2 靶DNA的PCR扩增及产物纯化
• 3.2.3 DNA微阵列的制备以及质量检测
• 3.2.3.1 微阵列的设计
• 3.2.3.2 微阵列的制备
• 3.2.3.3 DNA微阵列的质量检测
• 3.3.结果与讨论
• 3.3.1 靶基因片段的PCR扩增与纯化
• 3.3.2 芯片制备以及质量检测
• 3.3.小结
• 第四部分 HW-1的盐激表达谱分析及差异表达基因的功能验证
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂与试剂盒
• 4.1.4 实验器材与仪器
• 4.1.5 分析软件
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 M.fulvus HW-1在淡水与海水条件下的表达谱差异分析
• 4.2.1.1 M.fulvus HW-1总RNA的提取
• 4.2.1.2 RNA提取物的DNase I消化
• 4.2.1.3 cDNA反转录合成
• 4.2.1.4 cDNA产物的荧光标记
• 4.2.1.5 芯片杂交与洗涤
• 4.2.1.6 芯片杂交结果的检测与分析
• 4.2.2 微阵列数据的实时荧光定量PCR验证
• 4.2.2.1 实时荧光定量PCR引物的设计
• 4.2.2.2 实时荧光定量PCR
• 4.2.3 基因缺失载体的构建
• 4.2.3.1 同源臂引物设计
• 4.2.3.2 上下游同源臂的PCR扩增
• 4.2.3.3 上下游同源臂的连接及扩增
• 4.2.3.4 载体pBJ113的预处理
• 4.2.3.5 同源臂与载体的连接及验证
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 M.fulvus HW-1在淡水与海水条件下的表达谱差异分析
• 4.3.1.1 M.fulvus HW-1总RNA的提取
• 4.3.1.2 微阵列数据的归一化处理
• 4.3.1.3 淡水与海水条件下HW-1的表达差异
• 4.3.2 微阵列数据的实时荧光定量PCR验证
• 4.3.2.1 实时荧光定量PCR验证候选基因的选择及引物设计
• 4.3.2.2 实时荧光定量PCR产物特异性
• 4.3.2.3 实时荧光定量PCR的数据分析
• 4.3.3 基因的功能鉴定
• 4.3.3.1 缺失载体的构建
• 4.4 小结
• 结束语
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表