蓝色花形成关键基因的分离及其表达分析

论文摘要

具有新异花色的花卉往往具有可观的经济价值。利用基因工程技术培育新异的花色品种,是世界花卉育种的研究热点之一。世界销售量最大的切花中都缺少蓝色系,与蓝色月季和蓝色康乃馨的研究进展相比,蓝色菊花的研究刚刚起步。近十几年来对花色形成分子机理的逐步揭示,为通过调控蓝色花形成关键基因,培育蓝色花提供了可靠的理论依据。根据菊花的生物学特点和花色分子改良的研究进展,首先利用菊科中具有蓝色花的植物,研究其花色形成的分子机理,对于蓝色菊花的分子育种工作具有重要的理论和实践意义,这也是本研究的创新点之一。F3′5′H是蓝色的3′,5′-羟基花色素形成的关键酶。F3H和DFR分别催化F3′5′H的上、下反应步骤,与F3′5′H存有底物竞争关系。三者底物特异性的差异决定了不同植物中合成色素各组分的差异。本研究利用RT-PCR和RACE技术,检测了蓝色瓜叶菊、矢车菊、马蔺和飞燕草中F3′5′H的表达。从蓝色瓜叶菊和飞燕草中分离出了F3′5′H cDNA全长序列,命名为PCFH （GenBank accession no. AY791885）和DGFH （GenBank accession no. AY856345）。PCFH和DGFH与已知的矮牵牛、茄子、草原龙胆等植物的F3′5′H的氨基酸序列相似性较高（>40%）,同属于P450 CYP75亚家族。从瓜叶菊和菊花中分离出了F3H和DFR同源基因序列片段,与已知的裂叶牵牛和金鱼草等同源基因的序列相似性高,GenBank accession no. DQ471436、DQ471437、DQ471438和DQ471439。蓝色花形成关键基因的分离为揭示蓝色花形成的分子机理奠定了研究基础。将瓜叶菊的花序发育过程分为5个阶段,用Northern Blotting分析了花色素苷合成途径的早期、中期和晚期三个合成阶段的关键基因:CHS、F3H、F3′5′H和DFR在瓜叶菊花序不同发育时期的表达模式。四个基因在不同发育阶段表达量的明显增减变化说明蓝色瓜叶菊的飞燕草色素及其衍生物在花序发育的早期开放过程中就已大量合成,并非随着花序的开放会逐渐合成。F3H基因的持续表达说明瓜叶菊的蓝色花形成中产生的无色的二氢黄酮醇中间产物至少有两类:二氢杨梅黄酮（DHM）和二氢莰非醇（DHK）。CHS基因转录本在前三个时期的逐渐增加说明在花序发育过程中色素苷的大量合成集中在前两个发育阶段,噢哢、黄酮和黄酮醇等辅助色素的合成在花序的发育阶段持续较长的时间。结合色素薄层层析分析的结果,讨论了蓝色瓜叶菊中的色素合成途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略表
• 1 绪论
• 1.1 花色的形成机理
• 1.1.1 花瓣的内部结构与色素分布
• 1.1.2 色素的种类
• 1.1.3 花色素苷的遗传调控
• 1.1.3.1 花色素苷的化学性质
• 1.1.3.2 花色素苷生化合成途径
• 1.1.3.3 结构基因研究进展
• 1.1.3.4 调节基因研究进展
• 1.2 F3′5′H基因与蓝色花的形成
• 1.2.1 F3′5′H基因的分离
• 1.2.2 F3′5′H同源基因的结构分析
• 1.2.3 F3′5′H同源基因的系统进化
• 1.2.4 F3′5′H同源基因的表达特性
• 1.2.5 F3′5′H基因在花色素苷合成中的作用机理
• 1.2.6 F3′5′H与其它酶的底物竞争关系
• 1.3 蓝色菊花育种目标的确立
• 1.3.1 蓝色菊花育种的理论依据
• 1.3.2 菊科蓝色花植物资源简介
• 1.4 菊花转基因研究现状
• 1.4.1 转基因育种目标及改良株系
• 1.4.2 转基因效率与转基因沉默
• 1.5 本研究的设计思想
• 1.5.1 本研究的目的、意义
• 1.5.2 研究设计及研究内容
• 1.6 主要的技术路线
• 2 蓝色花形成关键基因的分离
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 菌株与质粒
• 2.1.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.1.4 PCR 引物
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 花瓣总RNA的提取
• 2.1.2.2 基因组DNA小量提取
• 2.1.2.3 反转录和PCR反应体系
• 2.1.2.4 RACE
• 2.1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.2.6 连接
• 2.1.2.7 转化及阳性克隆筛选
• 2.1.2.8 碱法小量提取质粒DNA及酶切鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 花瓣总RNA的提取
• 2.2.2 瓜叶菊F3′5′H基因cDNA全长的分离
• 2.2.2.1 瓜叶菊F3′5′H同源基因片段的克隆
• 2.2.2.2 瓜叶菊F3′5′H同源基因cDNA末端序列的克隆
• 2.2.2.3 瓜叶菊F3′5′H同源基因cDNA全长的克隆及序列分析
• 2.2.3 其它蓝色花植物中F3′5′H同源基因的分离
• 2.2.3.1 飞燕草F3′5′H同源基因片段的克隆
• 2.2.3.2 飞燕草F3′5′H同源基因末端序列的克隆
• 2.2.3.3 飞燕草F3′5′H同源基因cDNA 全长的克隆及序列分析
• 2.2.3.4 矢车菊和马蔺中F3′5′H同源基因的分析
• 2.2.4 DFR和F3H同源基因的分离
• 2.3 讨论
• 2.3.1 花瓣总RNA的提取方法
• 2.3.2 F3′5′H基因的序列分析
• 2.3.3 DFR和F3H的序列分析
• 2.3.4 矢车菊与马蔺蓝色花的形成
• 2.3.5 蓝色瓜叶菊中F3′5′H与F3′H基因是否共存
• 2.4 小结
• 3 瓜叶菊蓝色花形成关键基因的表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 主要试剂及其配制
• 3.1.2 Northern Blotting方法
• 3.1.3 Southern Blotting方法
• 3.1.4 花瓣色素的薄层层析分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 蓝色瓜叶菊色素苷合成关键基因在不同发育期的表达分析
• 3.2.2 瓜叶菊F3′5′H基因在不同花色系和器官中的表达分析
• 3.2.3 蓝色瓜叶菊F3′5′H和F3H基因的Southern Blotting分析
• 3.2.4 不同花色瓜叶菊色素成份的TLC分析
• 3.3 结论与讨论
• 3.3.1 基因表达特性的分析
• 3.3.2 蓝色瓜叶菊花色素合成途径的探讨
• 4 PCFH和DGFH在大肠杆菌中的表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 植物材料、菌株及质粒
• 4.1.1.2 PCR引物
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 主要试剂及其配制
• 4.1.2.2 目的蛋白的诱导
• 4.1.2.3 总蛋白提取
• 4.1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳
• 4.1.2.5 可溶性蛋白与包涵体分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 原核表达载体的构建
• 4.2.2 PCFH和DGFH基因在大肠杆菌中的表达
• 4.3 讨论
• 5 PCFH和DGFH对转基因烟草花色的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.1.1 植物材料
• 5.1.1.2 PCR引物
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 5.1.2.2 冻融法转化农杆菌
• 5.1.2.3 农杆菌介导的叶盘法转化烟草程序
• 5.1.2.4 阳性苗的PCR和PCR-Southern Blotting筛选
• 5.1.2.5 色素的HPLC分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 植物表达载体的构建
• 5.2.2 转基因烟草的培养与阳性苗筛选
• 5.2.3 PCFH对转基因烟草花色素合成的影响
• 5.2.4 DGFH对转基因烟草花色素合成的影响
• 5.2.5 转基因烟草花色变化的CIE分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 关于色素化学分析方法
• 5.3.2 关于转基因烟草花色变化的分析
• 5.3.3 关于叶盘法转化烟草和菊花
• 5.3.4 关于蓝色菊花转基因育种研究
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录一：攻读学位期间发表论文简介
• 附录二：载体和Marker
• 附录三：实验图表
• 博硕士论文同意发表的声明