论文摘要
猪捷申病（Talfan／Teschen Disease）是由猪捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）感染导致的、以猪的脑脊髓灰质炎、生殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎等临床症状为特征的一种病毒性传染病。PTV属于小RNA病毒科（Picornaviridae）捷申病毒属（Teschovirus），根据第十一届国际病毒学大会病毒分类委员会的重新分类，将原来的猪肠道病毒13个血清型中的一部分成员归为捷申病毒属。不同血清型的PTV引起猪发病的临床症状不同，其具有血清型的特异性。猪捷申病最早是由捷克斯洛伐克等欧洲国家于上世纪30年代报道的，随后确定了该病的病原是猪捷申病毒。目前，猪捷申病是世界范围内发生的猪传染病之一，给养猪业带来了严重的危害，因此，PTV的疫苗、诊断和免疫机理的研究倍受广大研究者的关注。目前，反向遗传操技术是病毒基因工程疫苗、基因功能及致病机制研究等的一个有效工具，因此在病毒的研究中得到了广泛的应用。为了构建PTV感染性克隆，本试验将PTV中国分离株Swine／CH／IMH／03全长基因组的4个相互重叠片段分别克隆到pBluscript SK（+）载体中，然后通过序列拼接，最终获得了PTV全长基因组克隆（pSK-PTVFL）。测序证实，我们获得的pSK-PTVFL中PTV-1基因组5’端为poly（C），后接非翻译区及开放阅读框（Open reading flame，ORF），3’端为poly（A）。除此之外，本试验在PTV-1基因组5’端外引入了KpnⅠ酶切位点，3’端外引入了SacⅡ酶切位点，以便在体外转录时进行质粒线性化。KpnⅠ下游引入了T7启动子，可以利用T7 RNA聚合酶进行体外转录合成RNA。概言之，我们获得全长克隆为：KpnⅠ-T7 promotor-PTV genome-Poly（A）-SacⅡ。和亲本毒株Swine／CH／IMH／03及其他PTV毒株序列比对发现，该克隆的5’-UTR和3’-UTR和PTV各毒株高度同源，其中与Talfan的同源性为100％，保证了5’-UTR和3’-UTR序列的完整和精确。该克隆的ORF区存在3个核苷酸及氨基酸位点突变，分别位于2A、2C和3D基因中，可以用作亲本毒株与工程毒的鉴别。同时，本试验对PTV Swine／CH／IMH／03 3’-UTR及5’-UTR进行了克隆、测序及序列比对，发现PTV各毒株间的3’-UTR序列只有不到100个碱基，但极为保守，只有10个位点存在碱基替换。PTV Swine／CH／IMH／03的5’-UTR和其他PTV毒株高度同源，其中和Talfan毒株同源性为100％。在上述构建PTV-1全长cDNA克隆的基础上，我们进行了PTV-1病毒挽救的工作，PTV-1病毒挽救进行了初步探讨。PTV-1全长cDNA克隆的成功构建及我们积累的PTV-1挽救经验，为后期进行基于PTV反向遗传操作的病毒基因组结构、功能及疫苗的研究奠定了基础。在PTV病毒中，3D蛋白是具有RNA依赖RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RDRP）活性蛋白，能介导机体产生特异性的抗体。在同科的口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）中，以3D蛋白作为诊断抗原已经建立了用于FMDV抗体检测的诊断方法，而且得到了广泛的应用。为了能够建立一种特异性的血清抗体检测方法，用于我国猪捷申病毒血清流行病学调查，本实验以pSK-PTVFL为模板，通过PCR扩增了PTV 3D蛋白基因，并将其克隆到原核表达载体pET30a（+），用1PTG对含重组质粒的E．coli BL21重组菌进行了诱导表达，SDS-PAGE结果表明，3D蛋白获得了大量表达，薄层扫描表明表达的目的蛋白占菌体总蛋白的66.1％。Western blot显示，表达的3D重组蛋白能被猪抗PTV的阳性血清识别，这为基于PTV 3D蛋白的快速ELISA诊断试剂盒的研究奠定了基础。