桑树转基因受体系统的建立及遗传转化研究

论文摘要

桑树（Morus L．）属多年生双子叶木本植物，是我国重要的经济树种，其叶片是家蚕（Bombyx mori L．）的主要天然饲料。因此，人们以获取桑叶为主要栽培目的，桑树也是蚕丝业可持续发展的重要物质基础。此外，桑树的药用价值近年来也已成为新的研究热点。桑树的转基因研究虽然起步较晚，但已探明桑树是农杆菌的易感树种。应用农杆菌介导法和基因枪法已将外源基因导入桑树体内，并在其中表达。迄今为止，成功转入桑树的外源基因多为抗性基因，如：抗菌肽基因、水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因等，其他有价值的基因尤其是具有特殊性状或高经济价值的基因转化研究较少。同时，桑树转基因也存在着再生体系建立困难，基因型依赖性强，转化效率不高等问题。在前人工作基础上，本研究从建立桑树高频再生体系入手，通过进一步优化遗传转化因素，建立了农杆菌介导的新的完整遗传转化系统。并应用此遗传转化系统，成功地将毛白杨生长素内运载体基因转入桑树，以期改善其经济性状。主要研究结果如下。 1 利用生物信息学软件和生物信息数据库资源，对前期克隆的毛白杨生长素内运载体基因PtAUX1及其编码的蛋白PtAUX1进行了生物信息学分析。结果表明，PtAUX1成熟肽编码区全长1760bp，该序列包含有一个1431bp的开放读码框架，编码477个氨基酸；PtAUX1蛋白定位于细胞膜上，共有9个强的跨膜区域；其二级结构含有丰富的α螺旋和大量的随机卷曲区域，仅有少量的β折叠区域。同时发现存在一个Aatrans保守结构域。PtAUX1与12个蛋白具有较高同源性。其中与Pt×PtLAX1的亲缘关系最近，同源性高达97％。 2 研究了新型植物生长调节剂噻重氮苯基脲（Thidiazuron，简称TDZ）对桑树不同外植体愈伤组织诱导及不定芽分化的影响。结果表明，TDZ对桑树幼茎、叶柄和子叶的愈伤组织诱导有极显著的影响。0.5-1.0mg／L的TDZ可以使幼茎、叶柄和子叶提早2-3d产生愈伤组织；在MS+TDZ 0.5mg／L+NAA 0.2mg／L培养基上，幼茎、叶柄和子叶可获得91.6％～100％的愈伤诱导率。TDZ对桑树外植体愈伤组织的诱导

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ABSTRACT

第一部分文献综述

第一章生长素极性运输研究进展

1 生长素极性运输的生理特点

2 生长素极性运输的机制

2.1 生长素极性运输的化学渗透偶联学说

2.2 生长素极性运输的载体

2.2.1 生长素内运载体AUX1

2.2.2 生长素外运载体PIN1

2.3 生长素极性运输的调控机制

2.3.1 PIN1依赖于肌动蛋白（actin）的小泡进行循环运输

2.3.2 NPA结合蛋白在外运载体的小泡循环中的作用

2.3.3 生长素外运载体在膜上的靶位特异结构域

3 生长素极性运输与植物的生长发育

3.1 生长素的极性运输与胚胎发育

3.2 生长素的极性运输与侧根的发育

3.3 生长素的极性运输与光形态建成

4 展望

第二章桑树基因工程研究进展

1 植物基因工程

1.1 外源基因的种类

1.2 外源基因的载体

1.3 植物遗传转化的方法

1.3.1 间接导入法

1.3.2 直接导入法

1.4 转化体的筛选与转基因植物的鉴定

1.5 转基因植物的田间释放及安全性评价

2 TDZ（噻重氮苯基脲）及其生物学效应

2.1 TDZ的分子结构

2.2 TDZ的细胞分裂素活性

2.3 TDZ调节植物形态发生的作用机理

2.4 TDZ在植物组织培养中的应用

2.4.1 TDZ与芽的增殖与再生

2.4.2 TDZ对愈伤组织的诱导

2.4.3 TDZ与体细胞胚的发生

2.4.4 TDZ与生根

2.5 TDZ的应用前景

3 桑树基因工程

3.1 桑树基因工程研究中的外源基因

3.1.1 β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因

3.1.2 抗菌肽基因

3.1.3 大豆球蛋白基因

3.1.4 几丁质酶基因

3.1.5 水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因

3.2 桑树遗传转化方法

3.2.1 叶盘转化法

3.2.2 基因枪法

3.2.3 茎尖转化法

3.2.4 整株转化法

3.3 桑树转基因研究进展

3.4 桑树转基因技术存在的问题与对策

3.4.1 提高遗传转化效率

3.4.2 减少假转化体的发生

3.4.3 分离和利用新的功能基因

3.5 展望

第二部分试验研究

第三章毛白杨生长素内运载体基因（PtAUX1）的生物信息学分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 PtAUX1基因序列分析

2.2 PtAUX1蛋白二级结构分析

2.3 PtAUX1蛋白的跨膜结构分析

2.4 PtAUX1蛋白的定位分析

2.5 PtAUX1蛋白的同源性搜索及系统进化分析

3 结果与分析

3.1 毛白杨生长素内运载体基因（PtAUX1）的获得

3.2 PtAUX1核苷酸序列及推导氨基酸序列

3.3 PtAUX1推导氨基酸序列统计分析

3.4 PtAUX1蛋白二级结构预测

3.5 PtAUX1蛋白的跨膜结构分析

3.6 PtAUX1蛋白的定位分析

3.7 PtAUX1蛋白的同源性搜索

3.8 PtAUX1蛋白的系统进化分析

4 小结与讨论

第四章桑树高频再生体系的建立

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试桑品种

2.1.2 外植体

2.1.3 仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 消毒与接种

2.2.2 培养基与培养条件

2.2.3 数据统计方法

2.2.4 数据分析方法

3 结果与分析

3.1 桑树无菌体系的建立

3.2 TDZ对桑树不同外植体愈伤组织的诱导

3.2.1 TDZ对桑树幼茎和叶柄愈伤组织的诱导

3.2.2 TDZ对桑树花器愈伤组织的诱导

3.2.3 TDZ对桑树子叶愈伤组织的诱导

3.2.4 TDZ对桑树不同外植体愈伤组织生长量的影响

3.3 桑树不同外植体愈伤组织的不定芽分化

3.4 桑树叶片高效再生体系的建立

3.4.1 桑树叶片愈伤组织的诱导

3.4.2 影响桑树叶片愈伤组织不定芽分化的因素

3.4.3 桑树叶片再生体系对抗生素的敏感性

4 讨论

5 本章小结

第五章毛白杨生长素内运载体基因（PtAUX1）转化桑树研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 质粒和菌株

2.1.3 培养基

2.1.4 试剂与仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 毛白杨生长素内运载体基因表达载体pBI121-PtAUX1的构建

2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.2.3 质粒DNA的提取与酶切

2.2.4 农杆菌GV3101感受态细胞的制备与pBI121-PtAUX1的转化

2.2.5 桑树叶盘遗传转化方法

2.2.6 影响桑树遗传转化效率的因素

2.2.7 转基因苗的检测

3 结果与分析

3.1 PtAUX1表达载体pBI121-PtAUX1质粒的构建

3.2 浸染农杆菌GV3101的转化与生长特性

3.2.1 浸染农杆菌GV3101的转化

3.2.2 浸染农杆菌GV3101的生长曲线

3.3 影响桑树叶盘遗传转化效率的因素

3.3.1 浸染菌液浓度与浸染时间对桑树遗传转化的影响

3.3.2 共培养时间对桑树遗传转化的影响

3.3.3 共培养基pH对桑树遗传转化的影响

3.3.4 共培养基中AS浓度对桑树遗传转化的影响

3.3.5 桑树叶盘遗传转化的最适条件

3.4 桑树转PtAUX1基因Km抗性苗的获得

3.4.1 转化处理

3.4.2 抗性芽的筛选

3.4.3 抗性苗的生根培养

3.5 转基因苗的分子生物学检测

3.5.1 PCR检测

3.5.2 Southern blotting鉴定

3.5.3 Northern blotting鉴定

4 讨论

5 本章小结

第六章毛白杨生长素内运载体基因PtAUX1的原核表达及转基因植株的Western检测

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 宿主菌、载体与工具酶

2.1.3 主要仪器设备与试剂

2.2 试验方法

2.2.1 PtAUX1基因原核表达载体的构建

2.2.2 PtAUX1蛋白的诱导表达

2.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析

2.2.4 PtAUX1蛋白多克隆抗体的制备

2.2.5 多克隆抗体效价测定（ELISA法）

2.2.6 多克隆抗体对PtAUX1蛋白的检测

2.2.7 SDS-PAGE与Western印迹分析

3 结果与分析

3.1 PtAUX1基因原核表达载体的鉴定

3.2 PtAUX1融合蛋白的获得

3.3 PtAUX1蛋白的纯化

3.4 PtAUX1蛋白多克隆抗体的制备与效价测定

3.5 多克隆抗体的鉴定

3.6 转基因桑树中PtAUX1基因在蛋白质水平的表达

4 讨论

参考文献

附录A：所用主要化学及分子生物学试剂和仪器设备

附录B：缓冲液及培养基的配制

附录C：所用缩写词及中文对照

致谢

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