KAI1/CD82在层黏素受体介导胆管癌侵袭和转移中的作用初步探讨

论文摘要

胆管癌是常见的胆道恶性肿瘤之一,其发病率有呈逐年上升的趋势,而影响其治疗和病人远期生存率的主要因素是肿瘤的局部侵袭和转移。肿瘤的侵袭和转移是多基因参与、多步骤完成的复杂过程,其中肿瘤细胞黏附、运动能力的改变,以及与细胞外基质间的相互作用是肿瘤发生侵袭转移的基础,也是肿瘤侵袭转移的关键环节。探讨影响这些环节的调控因素将有助于我们更深入的理解胆管癌侵袭和转移的机制。层黏素受体（laminin receptor,LNR）是介导细胞与细胞外基质层黏素（laminin,LN）黏附的跨膜糖蛋白受体,在几乎所有恶性实体肿瘤中表达上调,并与肿瘤的侵袭转移密切相关。LNR与LN特异性结合能诱导肿瘤细胞或宿主细胞分泌IV型胶原酶和基质金属蛋白酶（如MMP-2、MMP-9）等蛋白水解酶,降解基底膜中的LN和IV型胶原蛋白有助于肿瘤细胞的侵袭和转移。Givant-Horwitz等研究表明高转移性肿瘤细胞LNR表达上调还可诱导一系列跨膜信号传导系统的变化,引起细胞外信号调节激酶、c-Jun N-端蛋白激酶和p38 MAPK引发信号级联反应,促进肿瘤细胞的分裂和转移。我们前期研究表明,胆管癌中LNR表达上调并在多个环节介导胆管癌侵袭和转移,而运用LNR反义寡聚核苷酸转染高转移性胆管癌细胞,则能明显抑制LNR表达上调对胆管癌侵袭能力的促进作用。但是什么原因导致LNR表达上调?其分子机制如何?这是深入研究LNR表达上调介导胆管癌侵袭和转移机制的重要环节。KAI1/CD82是新近发现的特异性肿瘤转移抑制基因,定位于人染色体11p11.2,编码含267个氨基酸的蛋白质分子,相对分子量为29.61kD,属于跨膜4超家族（trans- membrane 4 superfamily, TM4SF）成员。KAI1/CD82在前列腺癌、肺癌、乳腺癌、消化管肿瘤、胰腺癌、膀胱癌等大多数肿瘤中表达减少或缺失,且与肿瘤侵袭转移密切相关。KAI1/CD82和其他TM4SF成员与整合素形成复合体,通过PKC、Rho GTPases、Src激酶家族等信号通道介导细胞的黏附,使肿瘤细胞不易脱离原发灶而抑制转移。Bo He等将KAI1/CD82转染前列腺癌Du145细胞后,发现细胞表面整合素α6减少,降低细胞与细胞外基质LN的黏附而抑制细胞的迁移能力。而LNR与α6共表达、交互影响,并能免疫共沉淀。由此我们推测,胆管癌中LNR表达上调可能与KAI1/CD82表达减少或缺失有关。深入研究KAI1/CD82在LNR介导胆管癌侵袭和转移中的作用,有助于我们深刻理解胆管癌侵袭和转移的调控机制,从而为寻求新的肿瘤治疗策略和方法提供理论依据。本课题正是基于KAI1/CD82和LNR均与肿瘤侵袭转移密切相关以及KAI1/CD82表达减少或缺失可能导致LNR表达上调的设想,以临床胆管癌组织标本和胆管癌细胞系QBC939为研究对象,探讨KAI1/CD82在LNR介导胆管癌侵袭和转移中的作用。实验设计如下:首先,采用免疫组织化学方法检测KAI1/CD82在胆管癌组织标本中的表达情况,并分析其表达水平及与临床病理参数的关系;其次,采用免疫组织化学方法检测分析在不同KAI1/CD82胆管癌组织中LNR的表达差异,分析两者的关系;最后,利用基因工程技术构建含人KAI1/CD82全长基因的重组真核表达质粒pIRES2- EGFP-KAI1/CD82,并经酶切和测序鉴定证实构建成功,通过脂质体转染胆管癌QBC939细胞,免疫细胞化学、Western blot检测胆管癌QBC939细胞过表达KAI1/CD82后LNR蛋白表达的变化。结果:1.KAI1/CD82在胆管癌组织中的阳性表达率（31.3%,15/48）明显低于其在正常胆管组织中的表达（87.5%,7/8）,两者间差异显著（χ2=6.891,P<0.01）。分化程度越高,KAI1/CD82阳性表达率越高（χ2=3.911,P<0.05）,KAI1/CD82在有转移组的阳性表达率较在无转移组的低（χ2=5.765,P<0.05）,而与患者的年龄、性别、肿瘤的部位和病理类型均无关（P>0.05）。这些结果表明,KAI1/CD82表达减少或缺失可能参与了胆管癌的侵袭转移,其表达下降或许可以作为胆管癌恶性程度的一个分子标志。2.LNR蛋白在胆管癌组织的阳性表达率为54.2%（26/48）,分化程度越低,LNR阳性表达率较高（χ2=6.970,P<0.05）,有转移组较无转移组明显升高（χ2 =9.952,P<0.01）,而与患者性别、年龄、肿瘤部位及病理类型无关（P>0.05）。提示LNR表达上调介导了胆管癌的侵袭转移。3.KAI1/CD82表达阳性的胆管癌组织LNR阳性表达率为20.0%（3/15）,而KAI1/ CD82表达阴性的胆管癌组织LNR阳性表达率为69.7%（23/33）,两者比较差异显著（χ2=10.259,P<0.01）。胆管癌组织中KAI1/CD82和LNR表达呈负相关（γ=-0.462,P<0.01）。提示KAI1/CD82表达减少或缺失可能导致LNR表达上调,进而介导胆管癌的侵袭转移。4.经过酶切、基因测序鉴定,真核表达载体pIRES2-EGFP-KAI1/CD82含有KAI1/CD82全长基因序列,说明质粒构建成功。5.通过脂质体分别转染pIRES2-EGFP-KAI1/CD82重组质粒及pIRES2-EGFP空载体至胆管癌QBC939细胞,免疫细胞化学和Western blot的方法检测转染后KAI1/ CD82、LNR蛋白的表达,结果显示:转染重组质粒的实验组KAI1/CD82蛋白的表达水平明显高于转染空载体的对照组（P<0.05）,而LNR蛋白的表达水平较转染空载体的对照组降低（P<0.05）,说明胆管癌QBC939细胞过表达KAI1/CD82可降低LNR蛋白表达。结论:1.胆管癌组织中KAI1/CD82表达减少或缺失。2.胆管癌组织中KAI1/CD82表达与胆管癌分化程度、侵袭转移密切相关。3.胆管癌组织中KAI1/CD82、LNR表达呈负相关。4.成功构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-KAI1/CD82,并经酶切和测序鉴定证实构建成功。5.胆管癌中LNR表达上调可能与KAI1/CD82表达减少或缺失有关。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 KAI1/CD82 在层黏素受体介导胆管癌侵袭和转移中的作用初步探讨
• 前言
• 第一部份 胆管癌组织 KAI1/CD82 的表达及与临床病理学表现间关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部份 胆管癌组织 KAI1/CD82 的表达与层黏素受体表达的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部份 胆管癌 QBC939 细胞过表达 KAI1/CD82 对层黏素受体表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述一 67kDa 层黏素受体与肿瘤的侵袭和转移
• 参考文献
• 文献综述二 肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82 的研究进展
• 参考文献
• 研究生期间发表的论文