胚胎工程技术在奶牛繁育中应用的研究

论文题目: 胚胎工程技术在奶牛繁育中应用的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 刘俊平

导师: 张涌

关键词: 超数排卵与胚胎移植,性别控制,胚胎体外生产,繁殖障碍,奶牛

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本试验对应用胚胎工程技术提高奶牛繁育效率进行了系统的研究,包括MOET 技术、IVP 技术、性别控制技术以及引起奶牛繁殖障碍疾病的防治等几方面,得到如下结果与结论: 1 共超排供体奶牛1127 头次,回收胚胎共10900 枚,可用胚胎数量为6942 枚,平均每头次获得胚胎数量为6.73 枚。应用3 种超排处理方案,即PSO1、PSO2 和PSO3,超排成功率分别为89.50%、90.02%和98.54%,平均回收可用胚胎数分别为6.12 、5.98 和7.56 枚,利用发情周期9～11 d 的自然发情奶牛直接超排,效果最好。2 对青年奶牛进行超排处理,应限制超排起始时间,15 月龄以上的青年奶牛超排效果较好;供体牛连续重复超排控制在3 次以内,连续4 次超排处理后极大降低胚胎可利用率;另外超排处理的间隔最短时间应该选择46～60 d;经产牛1～3 胎次超排效果较好,7 胎次以上差;产后间隔时间选取80～90 d 为宜。3 供体奶牛采用性控精液进行超排处理,平均回收胚胎数为9.02 枚,平均可用胚胎为4.70 枚,受胎率与正常体内胚胎移植后的受胎率接近,说明采用性控精液生产性控胚胎可行。4 研究中共处理受体牛5083 头,二次PG 法、CIDR 法和一次PG 法处理受体牛同期发情率分别为75%、78.33%和72%,受体移植后的妊娠率鲜胚达到55%以上,冻胚受胎率也在46%～47%,3 种处理方法结果相近。同期发情处理后青年受体牛比经产牛的利用率高,同时受体的营养水平严重影响受胎率。认为受体牛的同期发情以较为简便的二次PG 法处理为宜。自然发情受体的利用率达到85%,显著高于二次PG 法注射同期处理组,选取自然发情牛作为受体显著提高胚胎移植成功率。5 采用直接解冻和分步解冻2 种方法解冻胚胎,移植后受体受胎率分别为45.22%和47.64%,表明以EG 作为冷冻介质冷冻保存胚胎并于35℃解冻后可以直接移植。6 未孕受体牛以中医中药调理后进行同期发情处理,受体利用率显著提高,受胎率也有所增加;经产牛在产后20～25 d 应用GnRH 联合PG 调节激素水平,受体利用率和自然恢复组相近,而分娩到同期发情处理间隔缩短。7 直径为3~6 mm的卵泡所获得卵母细胞体外成熟,受精率和囊胚形成率较高;在成熟液中添加10 ng/mL的EGF,利于核质成熟;卵母细胞成熟过程中,颗粒细胞保持至少3层以上,可以为其成熟提供必要条件,并能促进精子获能和正常受精。8 Percoll法速度快,活精子数量多,但是多精子受精多,而上浮法回收精子数量少,可是精子的总体活力要高于Percoll法;在获能液中添加咖啡因对精子的活力和受精能力无显著的影响,甚至降低了精子的存活时间。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

综述部分

第一章 奶牛繁育技术的研究进展

1.1 牛胚胎移植技术研究进展

1.1.1 国内外牛胚胎移植的状况

1.1.2 牛同期发情技术的研究进展

1.1.3 牛超数排卵技术的研究进展

1.1.3.1 超数排卵技术

1.1.3.2 超数排卵技术的优化

1.1.3.2.1 主动增加用以超排的卵泡数

1.1.3.2.2 延长排卵前卵泡的发育来增加排卵数

1.1.3.2.3 小剂量FSH 预处理

1.1.3.2.4 抑制素主动免疫

1.1.3.2.5 GnRH 及其类似物的应用

1.1.4 同期发情与超数排卵研究的热点与难点

1.1.4.1 超数排卵前对超排效果的预测

1.1.4.2 影响超数排卵效果的因素

1.1.4.3 卵泡发育、排卵机理以及其动力学的研究

1.2 新型人工授精的研究发展

1.2.1 程序化人工授精技术

1.2.1.1 程序化人工授精技术理论基础-卵泡发育波

1.2.1.1.1 牛发情周期中的卵泡发育特点

1.2.1.1.2 卵泡发育波的产生机制

1.2.1.2 程序化人工授精处理程序

1.2.1.2.1 PGF_(2α)+PGF_(2α)法处理程序

1.2.1.2.2 GnRH+ PGF_(2α)法

1.2.1.2.3 OvSynch 法

1.2.1.3 以P4 为基础药物的处理程序

1.2.1.3.1 CIDR+EB 法

1.2.1.3.2 CIDR+PGF2α+EB 法

1.2.2 定时人工授精的时间

1.3.1 牛体外受精技术的研究简介

1.3.1.1 体外受精技术发展简史

1.3.1.2 牛IVF 技术发展

1.3.2 卵母细胞的体外成熟及调节

1.3.3 精子的体外获能与体外受精

1.3.3.1 受精作用机制

1.3.3.1.1 精子获能与顶体反应

1.3.3.1.2 精卵识别的分子基础

1.3.3.1.3 原核的形成与融合

1.3.3.2 精子体外获能

1.3.3.2.1 精子的洗涤处理

1.3.3.2.2 精子体外获能的主要途径

1.3.3.3 精卵受精准备同步化

1.3.4 早期胚胎体外培养(IVC)研究进展

1.3.4.1 胚胎体外发育阻滞

1.3.4.2 物理性因素对胚胎发育的影响

1.3.4.3 化学性培养液对胚胎发育的影响

1.3.4.4 共培养系统对胚胎发育的作用

1.4 牛活体采卵(Oocyte recovery from live cows)

1.4.1 内窥镜进行活体采卵技术

1.4.2 B 超介导的活体采卵技术

1.5 牛胚胎性别控制技术的研究进展

1.5.1 精子分离技术的研究

1.5.1.1 X、Y 精子的不同点比较

1.5.1.2 X、Y 精子的分离技术

1.5.1.3 免疫学分离法

1.5.1.4 流式细胞分类法

1.5.2 早期胚胎性别鉴定

1.5.2.1 细胞学方法

1.5.2.2 免疫学方法

1.5.2.2.1 细胞毒性分析法

1.5.2.2.2 间接免疫荧光法

1.5.2.2.3 囊胚形成抑制法

1.5.2.3 分子生物学方法

1.6 细胞核移植和转基因技术在家畜繁育中的应用

1.6.1 动物核移植和转基因技术概述

1.6.2 细胞核移植和转基因技术的应用

1.6.2.1 乳腺生物反应器的制作

1.6.2.2 在医学领域中的应用

1.6.2.3 在畜牧业中的应用

1.6.2.3.1 促进动物生长,提高畜产品品质

1.6.2.3.2 动物抗病育种

1.6.2.4 存在的问题

1.7 奶牛繁殖障碍管理体系研究进展

1.7.1 引起奶牛繁殖障碍的因素与疾病

1.7.1.1 机能紊乱引起的奶牛繁殖障碍

1.7.1.2 泌乳和增高产奶量引起繁殖下降

1.7.1.3 能量负平衡引起的繁殖障碍

1.7.2 产科疾病引起的奶牛繁殖障碍

1.7.2.1 卵巢囊肿

1.7.2.2 异常的黄体期延长

1.7.2.3 第一次排卵间隔延长

1.7.3 导致奶牛繁殖障碍的其他因素及解决策略

1.7.3.1 管理水平

1.7.3.2 全球环境变化

1.7.3.3 发情鉴定和定时授精

1.7.4 早期胚胎死亡

1.7.4.1 胚胎死亡时间的确定

1.7.4.2 影响早期胚胎损失发生的因素

1.7.4.3 降低牛胚胎死亡的策略

1.7.4.3.1 孕酮补充

1.7.4.3.2 延迟黄体溶解(退化)

1.7.4.3.3 定时排卵与定时授精

1.7.4.3.4 繁殖管理

1.8 动物繁育技术的产业化战略分析

试验部分

前言

第二章 奶牛超数排卵与胚胎移植(MOET)技术

2.1 材料与方法

2.1.1 供受体奶牛选择及试验地点

2.1.1.1 供体牛的选择

2.1.1.2 受体牛的选择

2.1.1.3 试验地点

2.1.2 主要试验药物与仪器设备

2.1.3 奶牛的超排方法

2.1.4 牛胚胎的回收采集

2.1.5 胚胎质量和级别的判定

2.1.6 胚胎的冷冻与解冻

2.1.6.1 胚胎的冻前处理

2.1.6.2 胚胎装管

2.1.6.3 胚胎冷冻程序选择

2.1.6.4 冷冻胚胎解冻

2.1.7 胚胎移植

2.1.7.1 受体牛同期发情处理

2.1.7.2 胚胎移植

2.1.8 试验分组及统计

2.2 结果

2.2.1 不同超排方案对超排结果的影响

2.2.2 青年奶牛发情周期不同阶段对超排结果的影响

2.2.3 不同月龄青年奶牛超排结果

2.2.4 重复超排次数和超排处理的间隔时间对超数排卵的影响

2.2.5 超排处理时卵巢状态对超排结果的影响

2.2.6 胎次与产后间隔时间对超排效果的影响

2.2.7 体内性控胚胎的生产和移植结果

2.2.8 冷冻胚胎解冻方式对移植结果影响

2.2.9 受体营养及生育状况对胚胎移植成功的影响

2.3 讨论

2.3.1 供体牛的选择和超排方案的确立

2.3.2 利用青年奶牛进行超数排卵结果分析

2.3.3 超排间隔时间与产后间隔时间对超排效果的影响

2.3.4 影响奶牛超排效果的其他因素分析

2.3.5 胚胎冷冻和解冻在MOET 中的应用

2.3.6 受体牛的因素对受胎率的影响

2.4 小结

第三章 受体牛同期发情控制的研究

3.1 材料与方法

3.1.2 胚胎来源

3.1.3 试验用药品及器械

3.1.4 同期发情处理方法

3.1.5 胚胎解冻与胚胎移植

3.1.6 中药对受体牛生殖生理的调理

3.1.7 试验分组与统计学分析

3.2 结果与分析

3.2.1 不同方法处理受体牛的同期发情效果观察

3.2.2 自然发情与同期处理后受体牛的利用

3.2.3 移植未孕受体牛和经产受体牛再次同期发情处理的利用

3.3 讨论

3.3.1 受体牛同期发情处理激素的选择及应用

3.3.2 提高受体牛同期发情利用率的措施

3.3.3 影响受体牛胚胎移植受胎率的因素分析

3.4 小结

第四章 奶牛体外胚胎批量生产的研究

4.1 材料与方法

4.1.1 试验使用药品与设备

4.1.2 试验时间与地点

4.1.3 牛卵泡卵母细胞复合体的采集与体外成熟

4.1.4 精子获能与体外受精

4.1.5 胚胎培养

4.1.6 胚胎细胞计数

4.1.7 数据处理

4.2 结果

4.2.1 卵泡直径与卵母细胞的成熟

4.2.2 EGF 对卵母细胞成熟的影响

4.2.3 颗粒细胞与卵母细胞成熟

4.2.4 精子处理方法与受精能力的比较

4.2.5 咖啡因对精子活力和获能的影响

4.2.6 不同蛋白质添加物对体外受精胚胎发育的影响

4.2.7 不同浓度NEaa(非必需氨基酸)与Eaa(必需氨基酸)对胚胎发育的影响

4.2.8 不同培养液组合对胚胎发育的影响

4.2.9 IGF-I 对牛胚胎体外发育的影响

4.2.10 颗粒细胞共培养对胚胎发育的影响

4.2.11 性控精液生产体外受精胚胎及移植

4.3 讨论

4.3.1 不同直径卵泡卵母细胞体外受精后的卵裂

4.3.2 EGF 对卵母细胞成熟的影响

4.3.3 颗粒细胞层对卵母细胞及胚胎发育的影响

4.3.4 Percoll 法与上游法对精子获能和活力的影响

4.3.5 咖啡因对精子活力和受精能力的影响

4.3.6 不同蛋白质添加物对体外受精胚胎发育的影响

4.3.7 NEaa 与Eaa 对胚胎发育的影响

4.3.8 不同培养液组合对胚胎发育的影响

4.3.9 IGF-I 对胚胎发育的作用

4.3.10 颗粒细胞共培养体系对胚胎发育的影响

4.3.11 性控胚胎的体外生产与批量移植

4.4 小结

第五章 应用PCR 技术鉴定奶牛胚胎性别的研究

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.1.1 精液和胚胎

5.1.1.2 主要试剂与设备

5.1.2 方法

5.1.2.1 体内胚胎的生产和性别鉴定前处理

5.1.2.2 体外胚胎的生产和性别鉴定前处理

5.1.2.3 牛基因组DNA 的提取

5.1.2.4 PCR 反应进行早期胚胎性别鉴定

5.1.2.4.1 引物的合成

5.1.2.4.2 胚胎基因组DNA 的准备

5.1.2.4.3 连续复合式PCR

5.1.2.4.4 扩增产物的检测

5.1.2.5 胚胎移植

5.1.3 试验数据的统计学分析

5.2 结果与分析

5.2.1 牛SRY 基因片段PCR 琼脂糖凝胶电泳结果

5.2.2 牛体内胚胎性别鉴定结果

5.2.3 牛体外胚胎性别鉴定结果

5.3.1 引物设计和PCR 反应条件是保证胚胎性别鉴定的基础

5.3.2 性别控制技术在实际应用中存在的问题

5.3.3 性别控制技术在畜牧业中的应用

5.4 小结

第六章 几种常见影响奶牛繁殖效率疾病的防治研究

6.1 材料和方法

6.1.1 实验动物

6.1.2 药品

6.1.3 实验方法

6.1.3.1 卵巢囊肿的诊断和治疗

6.1.3.1.1 卵巢囊肿及其诊断标准

6.1.3.1.2 卵巢囊肿的治疗方案

6.1.3.2 供体超排冲胚后黄体退化不全形成硬肿的治疗和预防

6.1.3.2.1 黄体退化不全形成硬肿及诊断

6.1.3.2.2 黄体退化不全形成硬肿治疗方案

6.1.3.3 持久黄体的诊断和防治

6.1.3.3.1 持久黄体及其诊断标准

6.1.3.3.2 持久黄体的防治方案

6.1.3.4 卵巢机能减退的治疗

6.1.3.4.1 卵巢机能减退及其诊断标准

6.1.3.4.2 卵巢机能减退的防治方案

6.1.3.5 慢性子宫内膜炎的诊断和防治

6.1.3.5.1 慢性子宫内膜炎及其诊断标准

6.1.3.5.2 慢性子宫内膜炎的防治方案

6.1.3.6 胚胎死亡的控制

6.1.3.6.1 胚胎死亡及其临床诊断

6.1.3.6.2 胚胎死亡的防治方案

6.2 结果与分析

6.2.1 卵巢囊肿的治疗结果

6.2.1.1 卵巢囊肿的治愈标准

6.2.1.2 临床治疗效果

6.2.2 黄体退化不全形成硬肿的治疗结果

6.2.2.1 黄体退化不全形成硬肿的治愈标准

6.2.2.2 临床治疗效果

6.2.2.3 黄体退化不全形成硬肿治愈牛与正常奶牛冲胚效果比较

6.2.3 持久黄体的治疗结果

6.2.3.1 持久黄体的治愈标准

6.2.3.2 临床治疗效果

6.2.4 卵巢机能减退的治疗结果

6.2.4.1 卵巢机能减退的治愈标准

6.2.4.2 临床治疗效果

6.2.5 慢性子宫内膜炎的治疗结果

6.2.5.1 慢性子宫内膜炎的治愈标准

6.2.5.2 临床治疗效果

6.2.6 早期胚胎死亡的预防效果

6.2.6.1 对胚胎死亡控制效果的评价

6.2.6.2 对胚胎死亡控制的效果

6.3 讨论

6.4 小结

参考文献:

结论

附录

致谢

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

• [1].牛羊胚胎工程技术产业化研究与应用[D]. 张立.西北农林科技大学2005

相关论文

• [1].奶牛性别控制技术研究[D]. 赵雪.西北农林科技大学2012
• [2].山羊和绵羊超数排卵及规模化胚胎移植技术研究[D]. 权富生.西北农林科技大学2010
• [3].牛妊娠期黄体形态结构及卵母细胞体外胚胎生产的研究[D]. 陈静波.西北农林科技大学2003
• [4].牛完全体外生产胚胎及胚胎性别鉴定取样方法研究[D]. 张建新.山西农业大学2005
• [5].肉用绵羊规模化胚胎移植生产技术体系的研究与应用[D]. 王玉琴.甘肃农业大学2005
• [6].建立牛胚胎体外生产体系和快速鉴定胚胎性别的方法[D]. 张志平.西北农林科技大学2006
• [7].水牛性别控制相关问题的研究[D]. 陆阳清.广西大学2008

标签：超数排卵与胚胎移植论文;  性别控制论文;  胚胎体外生产论文;  繁殖障碍论文;  奶牛论文;