美洲南瓜苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因克隆、表达分析及品种抗灰霉病研究

论文摘要

本文以有壳美洲南瓜和裸仁美洲南瓜为试材，进行了种皮PAL基因全长序列的克隆，生物信息学及表达分析，研究了植株不同发育时期不同组织部位PAL酶活和PAL基因的表达特性变化，明确了接种灰霉菌后裸仁美洲南瓜植株各个部位防御酶活性变化及其与PAL基因表达水平之间的关系。现取得以下结果：1.利用RT-PCR技术，克隆获得了有壳美洲南瓜（P3，P5）和裸仁美洲南瓜（P13，P15）种皮PAL基因的cDNA片段。分析结果表明P3、P13、P5、P15的PAL基因核苷酸和氨基酸序列与其他植物中已分离的PAL基因有很高的同源性，其氨基酸序列具有PAL-HAL功能域和酶活性中心特征序列（GTITASGDLVPLSYIA），同属于LyaseILike超家族。有壳和裸仁美洲南瓜种皮PAL基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比对结果显示P3和P13有25个核苷酸位点发生变异，15个位点氨基酸发生变化。P5和P15发生变异的核苷酸位点有20个，P15编码的氨基酸序列的中间部分与P5编码的氨基酸序列完全一致。2.利用RT-PCR，结合RACE技术克隆得到了有壳美洲南瓜（P3）种皮PAL基因的全长序列。将该基因命名为CP-PAL，序列长为1720bp，含有一个1359bp的ORF，可编码452个氨基酸，分子量为48.86KDa，等电点为6.55。通过BlastX比对表明P3种皮PAL基因序列及其氨基酸序列与黄瓜PAL基因及其氨基酸序列的相似性分别为85%和94%。CP-PAL包含PAL-HAL、PLN02457及pheamlyase三个结构域及酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA），属于LyaseILike超家族。CP-PAL不具有导肽及信号肽，为非跨膜蛋白，可能定位于细胞质及内质网上，属可溶性蛋白。系统进化树分析表明P3种皮PAL基因和黄瓜PAL基因的亲缘关系最近。CP-PAL蛋白三级结构主要以α-螺旋为主要结构元件，β-转角和无规卷曲较少。3.克隆获得裸仁美洲南瓜（P13）种皮PAL基因的全长序列。将该基因命名为CPL-PAL，序列长为2340bp，含有一个2115bp的ORF，可编码704个氨基酸，分子量为77.38KDa，等电点为6.34。P13种皮PAL基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同黄瓜PAL基因及其氨基酸序列相似性分别为80%和85%。CPL-PAL包含PAL-HAL、PLN02457及pheamlyase三个结构域，属于LyaseILike超家族。CPL-PAL蛋白不具有导肽及信号肽，为非跨膜蛋白，可能定位于细胞质、内质网及叶绿体上，为亲水性蛋白。系统进化树表明P13种皮PAL基因和黄瓜PAL基因的亲缘关系最近。三级结构分析可知CPL-PAL蛋白以α-螺旋为主要结构元件，β-转角和无规卷曲较少。4.在整个种皮发育过程中，PAL基因在裸仁美洲南瓜（P13，P15）中的相对表达量均低于其在有壳美洲南瓜（P3，P5）中的相对表达量。PAL基因在P3和P13种皮发育中的呈现相反对应的变化趋势，P3中PAL基因在自交授粉后20d后表达量增加，P13中20d后表达量则下降。有壳和裸仁美洲南瓜PAL基因在叶、茎、根、花瓣中均有表达，其中在叶和花瓣中的相对表达量均较高。有壳美洲南瓜植株不同组织部位PAL酶活及PAL基因的相对表达量在整个生育期均高于裸仁美洲南瓜，叶、茎、根中PAL的酶活性与其对应组织部位的PAL基因的表达量存在协同增加的趋势，均在开花期达到峰值。5.裸仁美洲南瓜抗病和感病品种接种灰霉病菌后，随着发病时间的延长，病情指数增加，植株叶片、叶柄、茎中的叶绿素含量下降，POD、PPO、PAL酶活性上升。抗病品种叶片、叶柄、茎中叶绿素含量、PAL、POD、PPO酶活性均高于感病品种。裸仁美洲南瓜抗病品种叶片、叶柄、茎中PAL基因的相对表达量均显著高于感病品种，叶片和茎中PAL基因达到表达高峰的时间也早于感病品种。灰霉病菌诱导后裸仁美洲南瓜不同组织部位PAL基因的表达水平与PAL酶活性的变化趋势存在差异。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 美洲南瓜及其种皮研究进展
• 1.1 美洲南瓜研究进展
• 1.1.1 美洲南瓜营养价值及光合特性
• 1.1.2 美洲南瓜病害研究
• 1.1.3 美洲南瓜分子标记及基因克隆研究
• 1.2 裸仁美洲南瓜种皮性状及其相关酶活性研究
• 2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）的研究进展
• 2.1 PAL 的存在和分布
• 2.2 PAL 的基本特性
• 2.3 PAL 的三维结构
• 2.4 PAL 对植物生理代谢的意义
• 2.4.1 在细胞分化和木质化中的作用
• 2.4.2 在植物色素形成过程中的作用
• 2.4.3 在调控黄酮类化合物合成中的作用
• 2.5 PAL 在植物逆境中的作用
• 2.5.1 PAL 在植物抗病中的作用
• 2.5.2 PAL 参与植物抗病的机制
• 2.5.3 PAL 与植物抗虫性的关系
• 2.6 PAL 基因的表达和克隆
• 2.6.1 植物 PAL 基因的结构
• 2.6.2 植物 PAL 基因表达的特点
• 2.6.3 植物 PAL 酶及基因的表达调控
• 2.6.4 PAL 基因的克隆及序列分析
• 3 实时荧光定量（FQ-PCR）研究进展
• 3.1 组织表达特异性分析
• 3.2 非生物胁迫条件下基因表达分析
• 3.3 生物胁迫条件下基因表达分析
• 4 灰霉病及其与植物相关防御酶活性的关系
• 4.1 灰霉病菌的分类学地位和形态学特征
• 4.2 瓜类灰霉病的发病症状
• 4.3 植物对灰霉病的抗性及与防御酶活性的关系
• 4.3.1 接种灰霉病病菌对植物的影响
• 4.3.2 外源物质诱导植物对灰霉病的抗性及与防御酶活性的关系
• 第二章 美洲南瓜种皮 PAL 基因 cDNA 片段克隆及分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 主要药品及仪器
• 1.2.2 种皮总 RNA 的提取
• 1.2.3 cDNA 第一链的合成
• 1.2.4 美洲南瓜 PAL 基因 cDNA 片段的克隆
• 1.2.5 PCR 产物的回收、克隆及测序
• 1.2.6 美洲南瓜 PAL 基因的生物信息学分析
• 2 结果分析
• 2.1 美洲南瓜种皮总 RNA 的提取
• 2.2 美洲南瓜种皮 PAL 基因 cDNA 片段的扩增
• 2.3 美洲南瓜种皮 PAL 基因 cDNA 片段序列分析
• 2.3.1 有壳美洲南瓜种皮 PAL 基因 cDNA 片段序列分析
• 2.3.2 裸仁美洲南瓜种皮 PAL 基因 cDNA 片段序列分析
• 2.4 有壳和裸仁美洲南瓜种皮 PAL 基因核苷酸和氨基酸序列比对分析
• 3 讨论与结论
• 第三章 有壳美洲南瓜种皮 PAL 基因全长序列克隆及其生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 主要药品及仪器
• 1.2.2 种皮总 RNA 的提取
• 1.2.3 cDNA 第一链的合成
• 1.2.4 有壳美洲南瓜（P3）种皮 PAL 基因末端快速克隆（RACE）
• 1.2.5 P3 种皮 PAL 基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列生物信息学分析
• 2 结果分析
• 2.1 有壳美洲南瓜（P3）种皮总 RNA 的提取
• 2.2 P3 种皮 PAL 基因 cDNA 中间序列的克隆及分析
• 2.3 P3 种皮 PAL 基因全长序列的克隆
• 2.3.1 种皮 PAL 基因 3′端和 5′端序列的获得
• 2.3.2 种皮 PAL 基因全长序列的获得
• 2.4 有壳美洲南瓜（P3）种皮 PAL 基因（CP-PAL）生物信息学分析
• 2.4.1 CP-PAL 基因全长核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分析
• 2.4.2 CP-PAL 蛋白功能域分析
• 2.4.3 CP-PAL 蛋白理化性质分析
• 2.4.4 CP-PAL 蛋白导肽、信号肽及亚细胞定位预测与分析
• 2.4.5 CP-PAL 蛋白功能位点分析
• 2.4.6 CP-PAL 蛋白跨膜结构域分析
• 2.4.7 CP-PAL 蛋白磷酸化位点预测
• 2.4.8 CP-PAL 蛋白疏水性/亲水性预测
• 2.4.9 CP-PAL 蛋白二级结构分析
• 2.4.10 CP-PAL 基因编码氨基酸固有无序化特性分析
• 2.5 CP-PAL 基因编码氨基酸序列多重比较、系统进化树构建及蛋白三级结构预测
• 3 讨论与结论
• 第四章 裸仁美洲南瓜种皮 PAL 基因全长序列克隆及其生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 主要药品及仪器
• 1.2.2 种皮总 RNA 的提取
• 1.2.3 cDNA 第一链的合成
• 1.2.4 裸仁美洲南瓜（P13）种皮 PAL 基因末端快速克隆（RACE）
• 1.2.5 P13 种皮 PAL 基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列生物信息学分析
• 2 结果分析
• 2.1 裸仁美洲南瓜（P13）种皮总 RNA 的提取
• 2.2 P13 种皮 PAL 基因 cDNA 中间序列的克隆及分析
• 2.3 P13 种皮 PAL 基因全长序列的克隆
• 2.3.1 PAL 基因 3′端和 5′端序列的获得
• 2.3.2 种皮 PAL 基因全长序列的获得
• 2.4 裸仁美洲南瓜（P13）种皮 PAL 基因（CPL-PAL）生物信息学分析
• 2.4.1 CPL-PAL 基因全长核苷酸序列及其推导的氨基酸序列对比分析
• 2.4.2 CPL-PAL 蛋白功能域分析
• 2.4.3 CPL-PAL 蛋白理化性质分析
• 2.4.4 CPL-PAL 蛋白导肽及信号肽分析
• 2.4.5 CPL-PAL 蛋白功能位点分析
• 2.4.6 CPL-PAL 蛋白亚细胞定位及跨膜结构域分析
• 2.4.7 CPL-PAL 蛋白磷酸化位点预测
• 2.4.8 CPL-PAL 蛋白疏水性/亲水性预测
• 2.4.9 CPL-PAL 蛋白二级结构分析
• 2.4.10 CPL-PAL 基因编码氨基酸固有无序化特性分析
• 2.5 CPL-PAL 基因编码氨基酸序列多重比较、系统进化树构建及蛋白三级结构预测
• 3 讨论与结论
• 第五章 PAL 基因在有壳和裸仁美洲南瓜种皮及植株中表达特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 主要药品及仪器
• 1.2.2 植物样品 PAL 酶活性测定
• 1.2.3 植物样品总 RNA 的提取
• 1.2.4 cDNA 第一链的合成
• 1.2.5 实时荧光定量 PCR
• 2 结果分析
• 2.1 有壳和裸仁美洲南瓜种皮发育过程中 PAL 基因的表达特性分析
• 2.1.1 PAL 基因在有壳美洲南瓜（P3，P5）种皮发育过程中的表达特性分析
• 2.1.2 PAL 基因在裸仁美洲南瓜（P13，P15）种皮发育过程中的表达特性分析
• 2.1.3 PAL 基因在有壳和裸仁美洲南瓜种皮中的表达差异分析
• 2.2 有壳和裸仁美洲南瓜植株不同发育时期不同组织部位 PAL 酶活性的变化
• 2.2.1 有壳美洲南瓜（Y1，Y2）植株不同发育时期不同组织部位 PAL 酶活性分析
• 2.2.2 裸仁美洲南瓜（W1，W2）植株不同发育时期不同组织部位 PAL 酶活性分析
• 2.2.3 PAL 酶活性在有壳和裸仁美洲南瓜植株不同组织部位对比分析
• 2.3 有壳和裸仁美洲南瓜植株不同发育时期不同组织部位 PAL 基因的表达特性分析
• 2.3.1 PAL 基因在有壳美洲南瓜（Y1，Y2）植株不同发育时期不同组织部位表达特性分析
• 2.3.2 PAL 基因在裸仁美洲南瓜（W1，W2）植株不同发育时期不同组织部位表达特性分析
• 2.3.3 PAL 基因在有壳和裸仁美洲南瓜植株不同组织部位表达差异分析
• 3 讨论与结论
• 第六章 灰霉病菌对裸仁美洲南瓜植株防御酶活性及 PAL 基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 灰霉病菌孢子悬浮液的制备
• 1.2.2 接种处理
• 1.2.3 病情指数统计
• 1.2.4 植株样品叶绿素含量的测定
• 1.2.5 植株样品 PAL 酶活性测定
• 1.2.6 植株样品 POD 酶活性测定
• 1.2.7 植株样品 PPO 酶活性测定
• 1.2.8 实时荧光定量 PCR
• 2 结果分析
• 2.1 裸仁美洲南瓜抗病和感病品种病情指数比较
• 2.2 裸仁美洲南瓜抗病和感病品种不同组织部位叶绿素含量变化
• 2.3 裸仁美洲南瓜抗病和感病品种不同组织部位防御酶活性变化
• 2.3.1 裸仁美洲南瓜抗病和感病品种不同组织部位 PAL 酶活性变化
• 2.3.2 裸仁美洲南瓜抗病和感病品种不同组织部位 POD 酶活性变化
• 2.3.3 裸仁美洲南瓜抗病和感病品种不同组织部位 PPO 酶活性变化
• 2.4 裸仁美洲南瓜抗病和感病品种不同组织部位 PAL 基因表达特性分析
• 3 讨论与结论
• 第七章 主要结论及创新点
• 1 主要结论
• 2 创新点
• 附图
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介
• 参考文献