论文摘要
目的采用基因转染和RNA干扰技术,以人淋巴瘤Raji细胞株和人结肠癌CW-2细胞株作为实验细胞,研究新基因HA117的耐药功能,并初步探讨HA117基因影响CW-2细胞耐药性的机制;通过建立裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型,进一步对HA117基因的耐药功能进行裸鼠体内实验验证。方法1构建双克隆质粒pSOS-HUS-HA117-HAi筛选靶向HA117基因的最佳siRNA。提取质粒pSOS-HUS的DNA,经酶切后与HA117基因进行克隆重组,得到重组质粒pSOS-HUS-HA117;设计合成5对靶向HA117基因的siRNA模板DNA,使其与重组质粒pSOS-HUS-HA117分别进行再重组,构建了5个双克隆质粒pSOS-HUS-HA117-HAi。把5个双克隆质粒分别转染293细胞,通过镜下观察、流式细胞仪及RT-PCR检测,筛选鉴定出对HA117基因RNA干扰效果最强的siRNA。2应用基因重组技术构建靶向HA117基因的RNA干扰载体pSES-HUS-HAi5及Ad-HAi5。提取pSES-HUS腺病毒穿梭质粒DNA,经酶切后与筛选出的最佳siRNA模板HAi5连接,转导感受态细菌DH5α,构建HA117基因的RNA干扰重组质粒pSES-HUS-HAi5;将pSES-HUS-HAi5导入腺病毒同源骨架质粒BJ-Adeasy中产生腺病毒质粒Adeasy- HAi5,脂质体介导的方法将Adeasy-HAi5转染入产病毒包装细胞HEK 293,通过乒乓感染收获高滴度HA117基因的RNA干扰重组腺病毒Ad-HAi5。3通过基因转染研究HA117基因对Raji、CW-2细胞株耐药性的影响。Raji细胞实验分3组:实验组（转染HA117基因的Raji/HA117细胞）,RNA干扰组（转染HA117基因及其RNA干扰载体的Raji/ HA117/HAi细胞）,空白对照组（未转染的Raji细胞）; CW-2细胞分组同Raji。采用脂质体介导重组质粒及重组腺病毒直接感染的方法分别对Raji细胞和CW-2细胞进行基因转染。用荧光显微镜、流式细胞仪检测各组细胞转染率,RT-PCR检测各组细胞HA117基因表达,MTT检测各组细胞对柔红霉素（DNR）、阿霉素（ADM）、甲氨喋呤（CTX）、长春新碱（VCR）及5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性。用AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PI）双染结合流式细胞仪的方法检测各组CW-2细胞的凋亡率。4通过建立裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型对HA117基因的耐药功进行裸鼠体内实验验证。在Balb/c裸鼠皮下接种具有HA117耐药性的CT26细胞悬液,建立Balb/c裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型。建模7天后把荷瘤裸鼠随机分为实验组（10只）和对照组（10只）。于当日在实验组裸鼠肿瘤内直接注射Ad-HA117病毒液,对照组裸鼠肿瘤内直接注射等量的Ad-null空病毒液。首次瘤内注射病毒24h后,从裸鼠腹腔注射5-FU对两组荷瘤裸鼠进行化疗。化疗2周后用B超测量肿瘤直径计算瘤体积, RT-PCR检测瘤组织内HA117基因mRNA的表达。通过比较2组荷瘤裸鼠化疗后瘤体积,研究HA117基因对裸鼠结肠癌移植瘤耐药性的影响。结果1经两次克隆重组,成功构建了5个双克隆质粒pSOS-HUS-HA117-HAi。经荧光显微镜观察、流式细胞仪及RT-PCR检测,5对模板DNA中HAi5转录的siRNA对HA117基因的干扰效果最强2经酶切及测序鉴定,成功构建了重组腺病毒穿梭质粒pSES-HUS-HAi5,将其与Bj-Adeasy同源重组及HEK293细胞包装得到重组腺病毒Ad-HAi5。经乒乓交互感染,收获的Ad-HAi5病毒感染液滴度达2.3×1011pfu/ml。3与未转染的Raji、CW-2细胞相比,转染HA117基因的Raji/HA117、CW-2/HA117细胞对DNR、ADM、VCR、CTX和5-FU的耐药指数均增高37倍（P<0.05）,同时转染HA117基因及其RNA干扰载体的Raji/HA117/HAi、CW-2/HA117/HAi细胞对上述五种化疗药物的耐药指数与未转染的Raji、CW-2细胞相比均无显著差异（P>0.05）。4转染HA117基因的CW-2细胞凋亡率为6.77%,未转染的CW-2细胞凋亡率11.47%（P<0.05）,两者具有显著性差异。同时转染HA117基因及其RNA干扰载体的CW-2细胞凋亡率为12.06%,与未转染的CW-2细胞凋亡率差异无显著性（p>0.05）。5用CT26细胞皮下接种裸鼠7 d后,20只裸鼠接种部位均出现直径在5 mm10mm的皮下结节,移植瘤模型建立成功。化疗前实验组和对照组组荷瘤裸鼠肿瘤的体积大小差异无显著性（P>0.05）,化疗2周后,实验组裸鼠瘤体积大于对照组裸鼠瘤体积（P<0.05）。结论1从靶向HA117基因的5对siRNA模板中,成功筛选鉴定出了对HA117基因RNAi效果最强的HAi5,为应用RNAi技术成功沉默HA117基因表达奠定了基础。2成功构建了HA117基因的RNA干扰重组质粒pSES-HUS-HAi5及重组腺病毒Ad-HAi5,收获的Ad-HAi5病毒液滴度为2.3×1011pfu/ml。3高表达外源性HA117基因的CW-2、Raji细胞对DNR、ADM、VCR、CTX和5-FU的耐药性增强,外源性HA117基因表达被沉默后的CW-2、Raji细胞对上述五种药物的耐药性消失,提示外源性HA117基因可使Raji、CW-2细胞产生多药耐药,表明HA117基因具有多药耐药功能;初步探讨HA117基因可能是通过抑制细胞凋亡的途径使瘤细胞产生多药耐药性。4新基因HA117可增强裸鼠结肠癌皮下移植瘤对5-FU的耐受性,进一步在动物体内实验表明HA117基因可使肿瘤细胞产生耐药性,是一个参与调控肿瘤细胞产生耐药性的新基因。
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