论文摘要
现代医疗技术的发展使许多以前难以开展的临床高难诊治技术得以实施,许多严重疾患病人因此得以存活,但危重病例比如脓毒症（sepsis）的发病率也因此日渐增加。由于目前脓毒症的治疗措施尚无显著进展,只有早期诊断、早期治疗才有助于降低其死亡率。内皮细胞既是脓毒症中的效应细胞和靶细胞,又在机体正常生理的维持中扮演着重要角色。因此,我们推测反映内皮细胞损伤的指标能间接反映脓毒症中组织的损伤和炎症轻重程度。在检测临床常规脏器功能指标的基础上,监测内皮细胞状态可望能更早、更敏感地判断机体脏器综合状况。而目前已有的评价内皮细胞损伤程度的指标都存在不同程度的不足之处。目的本实验拟通过在脓毒症动物模型中检测血液中循环内皮细胞（circulating endothelial cells,CECs）数量、内皮细胞特异性基因mRNA含量和脏器血管通透性、组织含水量来综合反映内皮细胞损伤程度。同时观察主要脏器组织学和功能的变化。分析内皮细胞损伤与重要脏器功能间的关系。并在动物实验的基础上,初步研究临床脓毒症患者内皮细胞损伤与全身病情变化的关联。方法1、大鼠脓毒症模型的制作及一般评价:90只大鼠分为6组,正常对照组,假手术（sham）组,盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）3h组,CLP6h组,CLP12h组和CLP24h组,每组15只。CLP大鼠结扎盲肠全长,16号针头穿孔3个;sham组仅做剖腹术。36只大鼠（每组6只）鼠尾采血计数术前、术后全血白细胞数量;术后相应时间点采集血清ELISA法检测IL-6含量。2、大鼠CLP后内皮细胞损伤的检测:36只大鼠（每组6只）CLP术后相应时间点采血应用密度梯度分离法分离、计数CECs。36只大鼠（每组6只）术后相应时间点采血提取全血RNA,荧光实时定量PCR（real-time PCR）检测内皮细胞特异性基因tie2、vegfr2的mRNA含量。应用伊文思兰法和干湿比重法检测18只（每组3只）大鼠心脏、肝脏、肾脏、回肠、肺脏组织的血管通透性和组织含水量变化。3、大鼠CLP后主要脏器功能变化的评价及其与内皮细胞损伤的关联分析:应用全自动生化分析仪检测36只大鼠（每组6只）K+、Na+、Cl-、AST、ALT、BUN和Cr的水平。同时HE染色观察心脏、肝脏、肾脏、回肠、肺脏的病理组织学变化。比较血循环中tie2、vegfr2的mRNA含量与上述生化分析指标的相关性。4、脓毒症患者内皮细胞损伤与病情变化的关联分析:选择重症监护病房（intensive care unit, ICU）的创伤患者,分为脓毒症组和非脓毒症组,在收入ICU的第1、3、7、14、21、28天采血提取全血RNA,real-time PCR检测血循环中tie2的mRNA含量。同时应用ELISA法检测血浆vWF的含量。分别分析tie2 mRNA含量与APACHEⅡ评分、vWF含量的关系。同时检测血白细胞总数、AST、ALT、BUN和Cr的水平,并将之与tie2 mRNA含量比较。结果1、大鼠脓毒症模型的一般评价:大鼠CLP后24小时死亡率为31.82%（7/22）。正常对照和sham组的白细胞数量无显著差异。CLP3h组白细胞数量显著升高（P <0.05）,之后逐渐下降。与正常对照组比较,CLP组IL-6水平随时间持续增长,但直到CLP后6h时IL-6增高幅度才具有统计学意义（P <0.05）,12h组、24h组IL-6水平进一步增加（P <0.01）。2、CLP后内皮细胞伤情的评价:与正常对照比较,CEC数量在CLP后3h达到峰值（P <0.05）,随后逐渐下降,CLP24h组CEC数量明显低于3h、6h组（P <0.05）。CLP3h组循环血内皮细胞特异性基因tie2 mRNA含量显著高于正常对照和CLP其余时间点（P <0.05）,但vegfr2 mRNA水平在正常对照和CLP组间无显著差异（P>0.05）。CLP后3h,大鼠心,肺的血管通透性明显增加（P <0.05）,CLP后6h观察到肝脏血管通透性的增加（P <0.05）。直到伤后12h肾脏的血管通透性才发生显著变化（P <0.05）。在伤后12到24h各脏器的血管通透性一直维持在较高水平（P <0.05）。CLP后3h,大鼠心、肾组织含水量增高（P <0.05）,12h时肝脏组织含水量上升（P <0.05）。3、大鼠CLP后主要脏器功能变化的评价:CLP后肝细胞充血、变性。CLP后3h出现局灶性肺不张,肺泡内红细胞渗出,并且不断加重。回肠黏膜充血、坏死、脱落。肾小球充血,小管内可见脱落的上皮细胞。心肌可见局灶性出血。与正常对照比较,AST、ALT和BUN分别在CLP6h和CLP12h出现显著增加（P <0.05）。血清K+、Na+、Cl-在CLP后有不同程度的升高（P <0.05）。4、脓毒症患者内皮细胞损伤程度与全身病情变化的关联分析:脓毒症组tie2 mRNA含量显著高于非脓毒症组（P <0.01）。患者的APACHEⅡ评分与相应时间点血循环中tie2 mRNA含量呈高度正相关（P <0.01）,Peason’s相关系数r =0.532（P <0.01）。其线形拟合方程为Y=12.66+4.922X （R2 =0.283）。血浆vWF含量在两组患者间无显著差异（P >0.05）,但与循环tie2 mRNA水平显著正相关（P <0.05）,Peason’s相关系数r =0.334（P <0.05）。其线形拟合方程为Y=180.932+57.93X （R2 =0.112）。脓毒症组全血白细胞总数显著高于非脓毒症组（P <0.01）。脓毒症组的BUN和Cr值也显著高于非脓毒症组（P <0.01）。AST和ALT在两组间均无显著差异（P > 0.05）。结论1、本试验制作的CLP脓毒症模型为后续的实验提供了可靠的模型基础。2、CLP后内皮细胞进行性损伤,表现为CECs数量和血液中tie2 mRNA含量增高,各主要脏器血管通透性增高,组织含水量增加。Real-time PCR检测tie2 mRNA能灵敏反映内皮细胞的损伤程度。3、CLP后大鼠主要脏器组织学水平进行性损伤加重,生化指标逐渐紊乱,但改变比内皮细胞损伤指标滞后。4、血循环tie2 mRNA水平能反映CECs数量的变化,是一个相对敏感的病情预测指标。早期监测tie2 mRNA水平结合已有的临床常规器官功能指标有助于提示器官功能损害和病程进展,及时针对治疗。
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